一、人脐静脉内皮细胞的分离培养与鉴定（论文文献综述）
刘倩[1]（2020）在《胚胎干细胞向内皮（祖）细胞分化与组织来源内皮细胞的比较》文中研究指明血管内皮细胞受损与许多心脑血管疾病的发生和发展有关,已成为在当今生命科学、药学领域中重要的研究对象。心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）是世界上导致死亡的主要原因之一,通常由内皮功能障碍引发;缺乏足够数量功能正常的内皮细胞（Endothelial cells,ECs）是阻碍了通过细胞替代治疗心血管疾病的原因之一。人类多能干细胞包括胚胎干细胞（Human embryonic stem cells,hESCs）和诱导多能干细胞（Human induced pluripotent stem cells,hiPSCs）可提供体外生产大量功能内皮细胞的机会,可用于移植,药物筛选或研究。然而,目前hESCs衍生ECs的分化方案多种多样,对其分化后内皮细胞类型特性的研究尚不完善,尤其是不同的分化方法以及基础培养液对于胚胎干细胞向内皮细胞分化的影响以及分化后细胞特性的区别尚未充分研究。为此本研究首先通过分离组织来源的人脐带和脐血的内皮细胞和内皮祖细胞,建立培养鉴定体系,然后通过建立多能干细胞分化为内皮细胞或内皮祖细胞的分化方案,对比不同基础分化培养液和及不同分化方法探究不同因素对分化后的分化细胞效率以及特性的影响。1、原代内皮细胞的分离培养与鉴定本研究首先通过了一种简便快捷、分离纯度高的人脐带动脉内皮细胞（Human umbilical cord artery endothelial cells,HUAEC）和脐带静脉内皮细胞（Human umbilical cord vein endothelial cells,HUVEC）的分离及培养体系,同时从形态特征、增殖活力、成管能力、表面抗原和特异基因的表达等方面检测了二者在体外相同培养环境下的动态变化与差异。发现,HUAEC和HUVEC在体外连续传代培养过程中形态特征、成管能力、表面抗原（CD144、CD31、CD309、CD133、CD34）这几个方面作为内个皮细胞的基本特性没有明显差异,对于新鲜分离的HUAEC和HUVEC,两者特异性基因表达水平具有显着差异（HUAEC高表达EFNB2、DLL4、NRP1、CXCR4;HUVEC高表达EPHB4、COUP-TFⅡ）,然而随着培养时间的延长（传代次数的增加）,HUAEC丧失其特异性基因的表达（P6之后）,但HUVEC仍保持其特异性基因的高表达。因此HUVEC特异性表达基因EPHB4、COUP-TFⅡ可以作为区分体外培养的人脐带动脉或者脐带静脉来源的内皮细胞的可靠鉴定标志基因。2、人胚胎干细胞向内皮细胞分化本研究通过拟胚体分化法将人胚胎细胞定向分化为内皮细胞,分化后的hESCs-ECs表达内皮细胞表面抗原CD31、CD144,并在体外基质胶上能形成管状结构;StemlineⅡ（CD31+CD144+:50%-60%）作为分化基础培养液相较于之前报道较多的Stempro 34（CD31+CD144+:30%）培养液具有更高分化效率;而ECM和EGM-2相较于StemlineⅡ和Stempro 34分化过程中细胞活力更好,CD31表达更高（70%-80%）,但是流式分析没有明显分群现象。所有方案的内皮细胞均尚未完全确定为动脉内皮或静脉内皮细胞命运,而处于较原始内皮细胞或内皮祖细胞状态,但是可以定性为Ⅱ型内皮细胞。3、人胚胎干细胞向内皮祖细胞分化通过比较拟胚体分化与单层贴壁分化发现,单层贴壁分化的hESCs-EPCs形态更为椭圆,形态较为均一。贴壁分化的hESCs-EPCs成管能力显着低于拟胚体分化的hESCs-ECs。所得到的内皮细胞表现为显着高表达内皮祖细胞的标记CD133,传代后有向成熟内皮细胞分化的趋势。而且贴壁分化而来hESCs-EPCs表现更高增殖活力传代次数。与内皮细胞分化一致,所有分化方案来源的内皮祖细胞均尚未完全确定为动脉内皮或静脉内皮细胞命运,而处于较原始内皮细胞或内皮祖细胞状态,但是可以定性为Ⅱ型内皮细胞。
袁杨[2]（2020）在《韭根挥发油对人脐静脉内皮细胞糖萼层作用及其机制研究》文中研究表明目的:观察韭根挥发油对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）糖萼层（ESL）的作用,及其对内皮细胞表达eNOS、caveolin-1、硫酸乙酰肝素等的影响,探讨韭根挥发油对血管内皮ESL的作用机制。方法:1.韭根挥发油的提取:将韭根洗净、阴干,用打粉机粉碎,装入圆底大烧瓶中,浸泡后放入电热套上,通过水蒸气蒸馏法,收集挥发油,再用乙醚萃取3次,得到本试验使用的韭根挥发油。2.人脐静脉内皮细胞的分离培养:洗净脐静脉,注入胶原酶Ⅰ,收集消化液,离心得到人脐静脉内皮原代细胞,使用人第VIII因子相关抗原荧光染色法进行原代细胞鉴定。用DME/F12培养基,于37℃、5%CO2的条件下培养。3.人脐静脉内皮细胞糖萼层（ESL）形态学观察及损伤模型建立:用不同浓度的脂多糖（0?g/mL、0.05?g/mL、0.1?g/mL）,分不同的时长（5min、10min、20min、30min）刺激人内皮细胞,使细胞ESL受到损伤。电镜下观察不同浓度LPS在不同时间对内皮细胞ESL形态的影响,为电镜观察ESL的形态变化筛选出适宜LPS浓度和损伤时间。4.韭根挥发油对损伤ESL的作用及机制研究:将人脐静脉内皮细胞随机分为8组,包括正常组,模型组,0.025%韭根挥发油10μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、60μL/mL、80μL/mL、100μL/mL等不同浓度给药组。ELISA法检测细胞培养上清液中硫酸乙酰肝素（HS）、透明质酸（HA）的含量;Western Blot方法检测人脐静脉内皮细胞eNOS、caveolin-1的表达。结果:1.400g韭根粉末可提取挥发油约0.5mL。2.胶原酶Ⅰ消化得到人脐静脉内皮细胞,细胞贴壁后呈长梭形聚集生长,使用人第VIII因子相关抗原荧光染色法对细胞进行鉴定,证明从脐静脉内消化下来的细胞为人脐静脉内皮细胞。3.人脐静脉内皮细胞ESL受损程度随着LPS浓度的升高和时间的延长而加重。电镜观察内皮细胞ESL形态,0.05?g/mL LPS刺激人脐静脉内皮细胞5min后,ESL已经开始脱落,10min时,与空白对照组相比较,ESL出现了较严重的损伤,但尚有部分残存,并未完全脱落,20min和30min时多数细胞ESL结构已不可见。而0.1?g/mL的LPS干预细胞时,内皮ESL多已消失。所以试验选择LPS对ESL损伤的合适浓度和时间分别为0.05?g/mL、10min。4.韭根挥发油干预损伤内皮细胞后,电镜下可以观察到ESL受损程度减轻;各组细胞上清液中HS、HA含量降低;韭根挥发油干预内皮细胞eNOS和caveolin-1的表达增高。结论:韭根挥发油可以促进HUVECs的生长,降低LPS对内皮细胞ESL的损伤程度,并促进其修复,其作用机制可能通过增加caveolin-1的表达,激活内皮细胞eNOS,维持HUVECs功能,促进损伤ESL修复。
赖涛[3]（2019）在《外源精胺对猪脐静脉内皮细胞血管形成的影响及其作用机理》文中提出胎盘血管的密度和大小决定着胎盘功能,对影响母猪的生产性能具有重大意义,研究胎盘血管的形成对改善母猪生产性能和胚胎健康生长具有重要价值。精胺是由细胞合成的,广泛存在于哺乳动物体内脂肪族胺类,对细胞的增殖分化具有重要作用。本项目旨在应用细胞生物学相关技术手段,从分子和细胞水平研究外源精胺对猪脐静脉内皮细胞血管形成相关基因和蛋白表达的影响,以及血管形成相关信号通路位点的基因表达。为寻找防止母猪胎盘功能不全带来的仔猪宫内发育迟缓的方法提供理论支持。为此,本项目展开如下试验:1.以正常分娩的猪脐带为材料,通过采用I型胶原酶灌注脐静脉,37℃消化15min,具有较好的内皮细胞分离效果。采用高浓度血清,促进原代细胞的生长。分离纯化后的内皮细胞通过形态学和抗CD31,抗vWF蛋白染色鉴定其为内皮细胞。2.不同浓度（0μM、2.5μM、5μM、7.5μM、10μM）的精胺不同程度的影响猪脐静脉内皮细胞的增殖,7.5μM精胺添加量对内皮细胞的增殖促进作用最大（P<0.05）。以7.5μM精胺添加量为试验组进行细胞迁移和管腔形成试验。7.5μM精胺处理组中细胞迁移数量与管腔形成数量显着高于（P<0.05）对照组。添加7.5μM精胺能够促进脐静脉内皮细胞体外血管形成。3.通过荧光定量PCR技术检测对照组和7.5μM精胺处理组中FGF-2、PLGF、ANG-1、VEGF-A、PI3K、AKT1、m-TOR、S6K1、MEK基因表达量。荧光定量结果表明7.5μM精胺处理组FGF-2、PLGF、m-TOR、MEK的基因表达量显着高于对照组（P<0.05）。
白雪晶,冯磊,徐文波,罗旋,鄢东海[4]（2018）在《人脐静脉内皮细胞培养技术的研究进展》文中认为血管内皮细胞连续覆在血管内膜,其具有重要的生理功能,广泛参与了炎性反应、血管新生、免疫应答、动脉粥样硬化、血管张力调节等生理及病理过程[1]。血管内皮细胞功能失调与许多心血管疾病的发生有关,冠心病的发生与血管内皮细胞的损伤与其功能异常有密切的关系[2]。内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞生物学与多种疾病关系的重要方法,是目前最简单可靠的被广泛运用于生理研究的人类血管细胞。随着细胞培养技术不断进步,文献报道了一种仪器,使用
陈小翠,陈邦党,杨毅宁,周韵,刘芬,盖敏涛,陈清杰,马依彤[5]（2016）在《人脐静脉内皮细胞分离培养和鉴定》文中提出目的建立简便、可靠、高效的体外分离培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的方法。方法利用2型胶原蛋白酶消化处理脐带分离HUVEC,采用内皮细胞培养基（ECM）进行培养。相差倒置显微镜观察细胞形态,免疫荧光技术检测冯·维勒布兰德因子（v WF）的表达,流式细胞术检测细胞表面CD31的水平鉴定细胞的纯度,体外成管实验检测冻存后内皮细胞的功能。结果成功分离培养出纯度高、活性好的HUVEC。原代HUVEC分离1周即可汇合成单层,细胞呈典型的鹅卵石状排列,免疫荧光技术证明细胞广泛表达v WF、CD31阳性细胞频数达93.1%。冻存后的细胞依然能形成管腔结构,证明标准化的冻存方法能很好地维持细胞的功能。结论建立了简便、可靠、高效的体外分离培养HUVEC的方法。
马振华,张连杰,马艳琴[6]（2015）在《人脐静脉内皮细胞分离培养方法的建立及优化》文中进行了进一步梳理为优化人脐静脉内皮细胞（HUVEC）原代及传代的培养方法,建立一种简便且能够获得数量较多及活力良好的HUVEC培养体系。分离脐静脉并插管,用0.1%的II型胶原酶灌注消化分离内皮细胞。M199完全培养基悬浮并接种于细胞培养瓶,37℃,5%CO2培养。待细胞铺满80%时,0.25%胰酶-EDTA消化传代培养。倒置显微镜观察内皮细胞生长情况,姬姆萨染色法鉴定内皮细胞的形态,vWF因子相关抗原免疫荧光法鉴定内皮细胞。比较不同胶原酶消化时间、不同接种密度、不同胰酶消化时间、不同培养基组分对细胞得率、形态和纯度的影响。结果表明,原代培养时,II型胶原酶最佳消化时间为15min,最佳接种密度为1×106 mL-1;传代培养时,胰酶最佳消化时间为2min。倒置显微镜下观察和姬姆萨染色结果显示,贴壁内皮细胞呈长梭形,且呈单层铺路石状排列。免疫荧光检测结果表明,细胞胞浆呈绿色荧光,为vWF因子阳性细胞,DAPI衬染细胞核呈蓝色,显示内皮细胞纯度接近100%。本实验成功建立了HUVEC原代分离培养的优化体系,纯度高、活力好,为后续研究做好了准备。
张培培[7]（2015）在《miR-206对婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖的影响及作用机制的研究》文中提出婴幼儿血管瘤（Infantile hemangioma, IH）是婴幼儿最常见的良性肿瘤之一。该病的发病率约为3-10%,其中女性、白种人、低体重的早产儿、多胞胎、高龄产妇的婴幼儿更易患病。根据病程的发展以及病理的变化,可以将IH分为增殖期、消退期、消退完成期。血管瘤的瘤体快速增长期往往在出生后的前5个月,以伴有血管内皮细胞的大量增殖为特点。大约10%的IH可以在1年内自行完成退化,而余下的90%的IH则需要9-10年,甚至更长的时间才能完全消退。IH为良性肿瘤,存在一定的自行消退的倾向,但目前关于IH自行消退的机制尚不完全清楚。microRNA属于小分子单链RNA,在真核细胞的基因表达调控中有着广泛的作用。我们前期对不同病程IH患儿的瘤体标本进行基因芯片分析,发现：miR-206是IH病程中是表达差异最大的一个miRNA,其含量在病程发展过程中逐渐升高,消退完成期水平是消退期的24倍。这就提示miR-206可能是IH自发消退的重要转录后调节因子。转化生长因子β （Transforming growth factor, TGFβ）信号通路在肿瘤发生和血管生成中具有重要的调控作用。对于IH这一血管内皮细胞源性肿瘤而言,TGFβ信号通路在病程的发展变化过程中起着重要作用。现研究表明：TGFβ在IH增生早期和消退晚期呈现弱表达,而在增生中晚期和消退早期则表现为强表达,提示TGFβ可能参与了IH血管内皮细胞增殖的负向调控,并在瘤体自发消退过程中起到了促进作用。然而,目前对TGFβ的具体调节机制尚不清楚。基于以上考虑,本课题以miR-206和TGFβ信号通路为研究对象,探究二者二者的关系,以及二者对婴幼儿血管瘤内皮细胞（Infantile hemangioma endothelial cells, HemEC）的影响,探究IH的消退机制。第一部分人脐静脉内皮细胞和婴幼儿血管瘤血管内皮细胞的分离、培养与鉴定实验目的分离、纯化、培养并鉴定人脐静脉内皮细胞和婴幼儿血管瘤血管内皮细胞两组细胞。实验方法1.收集1cm长人脐带标本,人脐静脉组织块直接粘附于皿底原代培养10d,通过镜下观察爬出的细胞形态,鉴别标记出形态规则如铺路石样细胞及组织块,挑出目的组织块,重新独立贴壁培养约3-4d,收集获得的细胞进行传代,扩增,保存。2.收集获取婴幼儿血管瘤手术后标本,通过血管瘤组织块颗粒原代培养6-7d,将爬出的细胞收集、培养、传代。待细胞量充足时,通过CD31免疫磁珠进行分选纯化,得到婴幼儿血管瘤来源的CD31表达阳性的细胞。3.将两组细胞的细胞形态学比较,并测定细胞生长曲线以比较生长特性。通过血管内皮细胞Matrigel基质胶成管实验、内皮细胞乙酰低浓度脂蛋白的摄取实验、细胞免疫荧光检测及细胞表面抗体的流式检测对组织块法培养的细胞进行鉴定。实验结果1.人脐静脉组织块法培养并依据镜下形态分选纯化获得的人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）,经流式细胞仪检测CD31阳性率达97%。2.增殖期婴幼儿血管瘤组织块培养法并经过免疫磁珠分选获得的HemEC,经流式细胞仪检测CD31阳性率达93.0%。3.两种细胞内吞实验均为阳性,生长曲线测定显示HemECs较HUVEC的增殖能力更强。4.成管实验显示HemEC较HUVEC具有更快的成管特性,较早出现管型,较早出现细胞聚集变化。5.细胞免疫荧光显示两组细胞CD31, CD 105, VEGF, GLUT1, vWF均表达阳性。实验结论我们证实通过收集的lcm人脐带标本,组织块法培养经细胞形态分选获得的细胞,经鉴定为HUVEC;通过收集增殖期婴幼儿血管瘤组织标本,组织块法培养经免疫磁珠分选获得的细胞,经鉴定为HemEC。细胞分离纯化的方法简便高效,获得的细胞纯度高,状态好,数量充足。HemEC的增殖能力较HUVEC细胞更强,HemEC的成管能力较HUVEC细胞更快。第二部分miR-206对婴幼儿血管瘤血管内皮细胞增殖的影响实验目的了解miR-206对HemEC增殖和凋亡能力的影响。实验方法1.转染miR-206 mimics, miR-206 mimics NC, miR-206 inhibitor, miR-206 inhibitor NC至HUVEC和HemEC中8h,通过倒置荧光显微镜拍照分析转染效率。2.转染后24h后,使用RT-PCR技术,借助于Taqman探针和SYBR Green染料检测各组细胞中的miR-206含量。3.通过CCK-8法检测转染后HemEC的增殖能力。4.借助PI染料和AnnexinV-FITC/PI染料,使用流式细胞仪检测miR-206对HemEC细胞周期的影响以及细胞凋亡的影响。实验结果1.转染后的荧光分析显示miR-206 mimics成功转染,转染效率高。2. TaqMan探针法RT-PCR检测显示miR-206 mimics转染后miR-206的表达水平约是阴性对照组miR-206 NC的50000倍,显着上调了HUVEC中的miR-206的表达水平（P<0.001）; miR-206的表达水平约是阴性对照组miR-206 NC的7500倍,显着上调了HemEC中的miR-206的表达水平（P<0.001）。3. SYBR Green法RT-PCR检测显示miR-206 mimics转染后,miR-206的表达水平约是阴性对照组miR-206 NC的70000倍,显着上调了HUVEC中的miR-206的表达水平（P<0.001）；miR-206的表达水平约是阴性对照组miR-206 NC的约100000倍,显着上调了HemEC中的miR-206的表达水平（P<0.001）4.CCK-8法检测显示miR-206转染后的HemEC的细胞增殖活性明显下降（P<0.05）,24h时miR-206抑制增殖能力最为显着（P<0.01）。5.细胞周期检测显示miR-206可使HemEC的S期比例下降,G2期比例增加。6.细胞凋亡检测显示miR-206使HemEC的凋亡比例变化不明显。实验结论miR-206 mimics可显着上调内皮细胞内miR-206的表达。提高miR-206的表达可有效抑制HemEC的细胞增殖,将细胞周期阻滞于G2期,但不能明显诱导HemEC的凋亡。第三部分miR-206抑制婴幼儿血管瘤血管内皮细胞的增殖的机制研究实验目的了解miR-206抑制婴幼儿血管瘤血管内皮细胞增殖的机制。实验方法1.通过KEGG数据库,分析miR-206具有调控作用的相关信号通路分析。2.通过Elisa法检测miR-206转染后HemEC后上清培养液中TGFβ1、TGFβ2、 TGFβ3以及BMP2、BMP4、BMP7的含量。3.借助于SYBR染料,使用RT-PCR分析miR-206转染HemEC后细胞内的smad2、smad4、smad7基因的mRNA表达水平。4.通过Western-blot检测miR-206转染HemEC后smad2、pp-smad2、smad4、 smad7蛋白表达水平。5.使用CCK-8法检测TGFβ1对HemEC增殖能力的影响。6.通过流式细胞仪检测TGFβ1对HemEC细胞周期的影响。7.通过流式细胞仪检测不同浓度的TGFβ1对HemEC细胞凋亡的影响。实验结果1.依据信号通路分析结果,结合miR-206可能的目标通路,选择TGF-beta signaling pathway作为研究对象。2.Elisa法检测显示miR-206 mimics转染后HemEC分泌的TGFβ1的含量较阴性对照组miR-206 NC显着提高（P<0.001）, miR-206抑制剂转染后HemEC分泌的TGFβ1,的含量较阴性对照组miR-206 inhibitor NC显着下降（P<0.001）。3. RT-PCR检测显示上调HemEC中miR-206的表达可使smad7的基因表达显着增多（P<0.01）,下调HemEC中miR-206的表达可使smad7的基因表达明显减少（P<0.05）。4. Western-blot检测显示上调HemEC中miR-206的表达可使smad7的蛋白表达增多,下调HemEC中miR-206的表达可使smad7的蛋白表达减少。5.CCK-8法检测显示TGFβ1浓度越高,抑制HemEC增殖越显着（P<0.01）,同一浓度TGFβ1共培养的时间越长抑制细胞增殖的能力越强（P<0.05）。6.细胞周期检测显示TGFβ1可使HemEC的S期比例增加。7.细胞凋亡检测显示不同浓度TGFβ1使HemEC的凋亡比例变化不明显。随着TGFβ1浓度的升高,HemEC的凋亡比例微升,但HemEC的凋亡比例变化无统计学意义。实验结论提高HemEC细胞内miR-206的表达可上调TGFβ1含量,上调smad7的蛋白表达。TGFβ1可明显可抑制HemEC的增殖活性,且其对细胞增殖活力的抑制作用随TGFβ1浓度的升高而增加。5ng/mLTGFβ1可以诱导细胞周期阻滞,出现S期阻滞,但TGFβ1诱导HemEC细胞凋亡作用并不明显。综上,miR-206可抑制HemEC的增殖,是IH的病程发展中重要的调控因子之一,其作用途径是通过上调HemEC中miR-206的表达从而正向调节TGFβ信号通路中TGFβ1及smad7的水平实现的。
戴青原,谭小兵,赵昭,胡家丽,郭涛[8]（2013）在《人脐静脉内皮细胞的原代培养和鉴定》文中研究说明目的:探索建立稳定有效的脐静脉内皮细胞体外培养方法。方法:用0.1%Ⅱ型胶原酶消化分离人脐静脉内皮细胞,加入含内皮细胞生长因子的M199完全培养液中培养,用胰蛋白酶-EDTA进行消化传代培养,用光镜和免疫组化方法对培养的细胞进行形态观察和鉴定。结果:原代培养的内皮细胞在接种后24 h后完全贴壁生长,第45天后融合呈铺路石样镶嵌排列,免疫组化可见胞浆中第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应,证实培养的细胞为内皮细胞。结论:脐静脉灌注Ⅱ型胶原酶消化法配合M199完全培养液可获得高纯度的内皮细胞,细胞可传代5-6次,但细胞产出量不高,不能传10代以上,5代以后细胞形态变化较大,对于复杂的基础研究应用受限。
林敏华,陈子春,林宇涵,许双临,富显果[9]（2013）在《人脐静脉内皮细胞培养方法的改进》文中研究说明目的建立高效、可靠、经济的人脐静脉内皮细胞原代培养方法,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。方法取健康剖腹产新生婴儿脐带,立即用0.1%Ⅰ型胶原酶室温消化,得血管内皮细胞,置于5%CO2、37℃培养箱进行原代培养,培养基采用M199培养基,含有10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、50μg/ml肝素钠、10 u/mlbFGF（贝复济,牛碱性成纤维细胞生长因子,basic fibro blast growth factor）、100 u/ml青霉素、50 u/ml庆大霉素。在倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态特点,同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。结果采用0.1%Ⅰ型胶原酶灌注法及改良培养基获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞。光镜下观察见大量34个成团的内皮细胞。细胞接种后4 h开始贴壁生长,5 d左右可融合成片,原代细胞呈小三角形、圆形或梭形,细胞分布不均匀,成簇生长,互不重叠;传代细胞多为扁平多角形铺路石状镶嵌排列,3 d左右可融合成片。免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。结论Ⅰ型胶原酶灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可取方法,成功率高,可靠性大。改良培养基能很好地促进内皮细胞体外培养及传代扩增,可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。
胡泉,柴家科,刘玲英,侯玉森,王一贺,李百玲,杨红明[10]（2013）在《犬脐静脉血管内皮细胞的分离培养与鉴定》文中研究指明目的建立一种简便、高效的犬脐静脉血管内皮细胞分离方法,并进行培养和鉴定。方法无菌条件下取12只新生比格犬脐带共12根,脐带长（13.0±1.5）cm。PBS液冲洗后,各取4根脐带注入1%Ⅰ型胶原酶分别消化脐静脉5、7、10 min后,收集细胞并行锥虫蓝计数;倒置相差显微镜下观察细胞形态,待细胞爬满培养瓶后以1∶2比例传代。取Ⅰ型胶原酶消化7 min获得的第3代细胞,通过免疫荧光染色和流式细胞仪检测细胞中血管假性血友病因子（vonWillebrand factor,vWF）和血小板-内皮细胞黏附分子CD31表达,进行细胞鉴定;MTT检测细胞增殖。结果消化5、10 min后未收集到或偶尔收集到血管内皮细胞;消化7 min可见大量血管内皮细胞,培养24 h后细胞呈多角形,随培养时间延长细胞逐渐呈"铺路石"样生长,细胞核较大,多为单核,少数细胞为双核,传代后细胞形态无明显变化。荧光倒置显微镜下观察,培养细胞vWF和CD31表达阳性;流式细胞仪检测示培养细胞vWF阳性表达率为99.0%±0.7%,CD31阳性表达率为98.0%±1.2%,提示培养细胞为血管内皮细胞。MTT检测示,随培养时间延长,血管内皮细胞增殖速度明显提高。结论采用酶消化法从犬脐静脉中分离培养血管内皮细胞操作简便,且细胞数量多、纯度高。
二、人脐静脉内皮细胞的分离培养与鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人脐静脉内皮细胞的分离培养与鉴定（论文提纲范文）
（1）胚胎干细胞向内皮（祖）细胞分化与组织来源内皮细胞的比较（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 内皮细胞 |
| 1.2 胚胎干细胞 |
| 1.3 胚胎干细胞向内皮细胞分化研究 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 人脐带内皮细胞的分离培养与鉴定 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 组织材料 |
| 2.1.2 试剂及药物 |
| 2.1.3 实验设备与仪器 |
| 2.1.4 实验试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人脐带动静脉内皮细胞的分离 |
| 2.2.2 细胞形态学观察 |
| 2.2.3 细胞增殖活力检测 |
| 2.2.4 流式细胞术分析 |
| 2.2.5 成管试验 |
| 2.2.6 细胞总 RNA 提取、反转录及 qRT-PCR |
| 2.2.7 统计与分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HUAEC和 HUVEC的细胞形态和增殖活力 |
| 2.3.2 HUAEC和 HUVEC的成管能力 |
| 2.3.3 HUAEC 和 HUVEC 的表面特异膜蛋白表达 |
| 2.3.4 HUAEC和 HUVEC的特异基因表达 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 人脐血内皮祖细胞的分离培养与鉴定 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 试剂及药物 |
| 3.1.3 实验设备与仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 人脐血内皮祖细胞分离培养 |
| 3.2.2 细胞形态学观察 |
| 3.2.3 成管试验 |
| 3.2.4 流式细胞术分析 |
| 3.2.5 集落形成实验 |
| 3.2.6 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 人脐血内皮祖细胞的细胞形态 |
| 3.3.2 人脐血内皮祖细胞的成管能力 |
| 3.3.3 人脐血内皮祖细胞的表面抗原表达 |
| 3.3.4 人脐血内皮祖细胞的集落形成能力(CFU) |
| 3.4 小结 |
| 第四章 人胚胎干细胞向内皮细胞分化 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 细胞系 |
| 4.1.2 试剂及药物 |
| 4.1.3 实验设备与仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 人胚胎干细胞培养传代 |
| 4.2.2 拟胚体分化 |
| 4.2.3 细胞形态学观察 |
| 4.2.4 流式细胞术分析 |
| 4.2.5 成管实验 |
| 4.2.6 细胞总 RNA 提取、反转录及 qRT-PCR分析 |
| 4.2.7 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 hESCs-ECs的细胞形态 |
| 4.3.2 hESCs-ECs成管能力的差异 |
| 4.3.3 hESCs-ECs表面抗原的表达 |
| 4.3.4 hESCs-ECs 特异基因的表达 |
| 4.3.5 hESCs-ECs增殖活力的差异 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 人胚胎干细胞分化为内皮祖细胞 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 细胞系 |
| 5.1.2 试剂及药物 |
| 5.1.3 实验设备与仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 单层贴壁分化 |
| 5.2.2 细胞形态学观察 |
| 5.2.3 流式细胞术分析 |
| 5.2.4 成管实验 |
| 5.2.5 细胞总 RNA 提取、反转录及 qRT-PCR分析 |
| 5.2.6 统计与分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 hESCs-EPCs的细胞形态 |
| 5.3.2 hESCs-EPCs表面抗原的表达 |
| 5.3.3 hESCs-EPCs的成管能力 |
| 5.3.4 hESCs-EPCs的特异性基因表达 |
| 5.3.5 hESCs-EPCs增殖活力的差异 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（2）韭根挥发油对人脐静脉内皮细胞糖萼层作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 韭根的药用植物学特征 |
| 1.1 韭根概述 |
| 1.2 韭根的药用文献考证 |
| 1.3 韭根的现代药学研究 |
| 1.3.1 韭根的药理学研究 |
| 1.3.2 韭根的主要化学成分 |
| 1.3.3 韭根挥发油的药学研究 |
| 1.3.4 韭根挥发油的主要成分 |
| 1.3.5 韭根挥发油的提取 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 人脐静脉内皮细胞分离培养及ESL损伤模型建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.2 人脐静脉内皮细胞的分离、培养及鉴定 |
| 2.2.1 原代提取的器械准备 |
| 2.2.2 原代提取的实验步骤 |
| 2.2.3 细胞传代 |
| 2.2.4 细胞冻存 |
| 2.2.5 细胞复苏 |
| 2.2.6 细胞计数 |
| 2.2.7 人脐静脉内皮细胞的鉴定 |
| 2.3 人脐静脉内皮细胞糖萼层损伤模型的建立 |
| 2.3.1 实验分组 |
| 2.3.2 扫描电镜制样 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 正常人脐静脉内皮细胞在光镜下的形态 |
| 2.4.2 人脐静脉内皮细胞的鉴定 |
| 2.4.3 不同浓度脂多糖在不同作用时间下对糖萼层的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 韭根挥发油对HUVECs损伤ESL作用及机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验药物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 CCK-8 检测韭根挥发油对HUVECs生长的影响 |
| 3.2.2 电镜观察韭根挥发油对HUVECs损伤ESL的作用 |
| 3.2.3 ELISA法测各组细胞培养上清液中HS和 HA的含量 |
| 3.2.4 Western blot检测HUVECs caveolin-1和eNOS的表达 |
| 3.2.5 统计学处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 韭根挥发油对HUVECs生长的影响 |
| 3.3.2 韭根挥发油对HUVECs损伤ESL形态的影响 |
| 3.3.3 韭根挥发油对损伤HUVECs糖萼层的保护作用 |
| 3.3.4 韭根挥发油对损伤HUVECs表达e NOS和 caveolin-1 的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）外源精胺对猪脐静脉内皮细胞血管形成的影响及其作用机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究进展 |
| 2.1 胎盘血管生成对胎儿宫内发育的影响 |
| 2.1.1 胎儿宫内发育迟缓对养猪业的影响 |
| 2.1.2 胎盘血管的结构和功能 |
| 2.1.3 猪胎盘血管形成 |
| 2.1.4 影响血管生成的调控因素 |
| 2.1.5 胎儿宫内发育迟缓与胎盘血管生成的关系 |
| 2.2 精胺简介 |
| 2.2.1 精胺的来源与代谢 |
| 2.2.2 精胺对细胞增殖的调节作用 |
| 2.2.3 精胺对血管系统的调节作用 |
| 2.2.4 精胺对胎盘发育的调节作用 |
| 2.3 精胺在猪生产上的应用 |
| 2.3.1 精胺在哺乳仔猪营养上的应用 |
| 2.3.2 精胺在断奶仔猪生产上的应用 |
| 2.3.3 精胺在母猪生产上的应用 |
| 3 研究目的与意义 |
| 4 技术路线 |
| 第二部分 试验研究 |
| 试验一 猪脐静脉内皮细胞分离培养 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂、耗材、仪器与动物 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 试剂配置 |
| 1.1.3 主要耗材 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 试验材料 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.2.1 脐静脉内皮细胞分离 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 猪脐静脉内皮细胞分离和培养 |
| 1.3.2 细胞纯化分离 |
| 1.3.3 细胞免疫荧光法鉴定 |
| 1.3.4 细胞生长曲线的制定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 脐静脉内皮细胞原代培养 |
| 2.2 脐静脉内皮细胞分离免疫荧光鉴定结果 |
| 2.3 细胞接种数的确定和生长曲线的绘制 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验二 外源精胺对脐静脉内皮细胞血管形成的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂仪器 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要试剂耗材 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.3 试验项目与方法 |
| 1.3.1 脐静脉内皮细胞增殖试验 |
| 1.3.2 脐静脉内皮细胞Transwell模型迁移试验 |
| 1.3.3 脐静脉内皮细胞管腔形成试验 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同浓度精胺对脐静脉内皮细胞活力的影响 |
| 2.2 精胺对脐静脉内皮细胞在Transwell模型迁移的影响 |
| 2.3 不同浓度精胺对脐静脉内皮细胞管腔形成的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验三 外源精胺对猪脐静脉内皮细胞血管生成相关基因表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂、耗材、仪器 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要耗材 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 测定项目与方法 |
| 1.3.1 荧光定量PCR法测定细胞生长因子和相关信号通路位点基因的表达 |
| 1.3.1.1 总RNA的提取 |
| 1.3.1.2 RNA反转录 |
| 1.3.1.3 引物设计与合成 |
| 1.3.1.4 荧光定量PCR扩增 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 外源精胺处理对猪脐静脉内皮细胞PLGF、VEGF-A、ANG-1、FGF-2 基因表达的影响 |
| 2.2 外源精胺处理对猪脐静脉内皮细胞PI3K、AKT1、m-TOR、S6K1、MEK的mRNA表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 荧光定量PCR的溶解曲线 |
| 致谢 |
（4）人脐静脉内皮细胞培养技术的研究进展（论文提纲范文）
| 1 细胞获取方式 |
| 1.1 非酶法: |
| 1.2 酶消化法: |
| 2 脐静脉内皮细胞的培养 |
| 3 脐静脉内皮细胞的鉴定 |
| 3.1 形态学观察: |
| 3.2 免疫组织化学染色: |
| 3.3 细胞纯度检测: |
| 3.4 细胞增殖检测: |
| 3.5 冻存后复苏后管腔形成实验: |
| 4 展望 |
（5）人脐静脉内皮细胞分离培养和鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1. 1 材料 |
| 1. 2 方法 |
| 1.2.1 HUVEC的分离及培养 |
| 1.2.2免疫荧光技术检测v WF表达 |
| 1.2.3流式细胞术检测HUVEC纯度 |
| 1.2.4成管实验检测HUVEC冻存后的功能 |
| 2 结果 |
| 2. 1 分离培养的细胞呈铺路石状生长 |
| 2. 2 分离的细胞表达v WF |
| 2. 3 分离获得高纯度HUVEC |
| 2. 4 HUVEC冻存复苏后仍具有成管能力 |
| 3 讨论 |
（6）人脐静脉内皮细胞分离培养方法的建立及优化（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1.1材料 |
| 1.2方法 |
| 1.2.1HUVEC原代分离培养 |
| 1.2.2原代细胞不同接种密度的比较 |
| 1.2.3HUVEC传代时胰酶处理时间的比较 |
| 1.2.4HUVEC的鉴定 |
| 2结果与分析 |
| 2.1胶原酶不同消化时间对细胞纯度的影响 |
| 2.2不同接种密度细胞生长状态的比较 |
| 2.3不同胰酶消化时间对传代后细胞数量及活力的影响 |
| 3结论与讨论 |
| 3.1HUVEC分离培养条件的优化 |
| 3.2HUVEC培养基的选择 |
（7）miR-206对婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖的影响及作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 前言 |
| 第一部分 人脐静脉内皮细胞和婴幼儿血管瘤血管内皮细胞的培养及鉴定 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第二部分 miR-206对婴幼儿血管瘤血管内皮细胞增殖的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第三部分 miR-206抑制婴幼儿血管瘤血管内皮细胞增殖的机制研究 |
| 第一节 信号转导通路Pathway的显着性分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第二节 TGFβ信号通路在miR-206抑制婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖中的作用研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述：婴幼儿血管瘤的发病机制、并发症及治疗进展 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）人脐静脉内皮细胞的原代培养和鉴定（论文提纲范文）
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 地点、材料和主要仪器 |
| 1.1.1 地点和材料 |
| 1.1.2 主要试剂和实验仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试剂配制 |
| 1.2.2 HUVECs的分离和培养 |
| 1.2.3 人脐静脉内皮细胞的传代培养 |
| 1.2.4 HUVECs的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 原代和传代培养的HUVECs形态观察 |
| 2.2 HUVECs的鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 HUVECs的分离培养 |
| 3.2 HUVECs的鉴定 |
（9）人脐静脉内皮细胞培养方法的改进（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 标本来源与采集 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 人脐静脉内皮细胞的原代分离培养 |
| 1.2.2 人脐静脉内皮细胞的传代培养 |
| 1.2.3 人脐静脉内皮细胞的鉴定 |
| 1.2.3. 1 光镜形态学观察 |
| 1.2.3. 2 免疫细胞化学染色法鉴定 |
| 1.2.4 生长曲线 |
| 2 结果 |
| 2.1 人脐静脉内皮细胞光镜形态学观察 |
| 2.2 人脐静脉内皮细胞免疫细胞化学染色法鉴定 |
| 2.3 生长曲线 |
| 3 讨论 |
| 3.1 污染是细胞培养中的重要问题 |
| 3.2 脐带要新鲜 |
| 3.3 消化酶的选择是影响分离效果的决定性因素 |
| 3.4 掌握胶原酶最佳消化时间、条件,是保证实验成功的关键之一 |
| 3.5 培养基成分及p H值是必须注意的关键环节 |
| 3.6 常用鉴定方法 |
（10）犬脐静脉血管内皮细胞的分离培养与鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验标本 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 犬脐静脉血管内皮细胞分离及培养 |
| 1.4 观测指标 |
| 1.4.1 犬脐静脉血管内皮细胞鉴定 |
| 1.4.2 MTT检测细胞增殖 |
| 2 结果 |
| 2.1 血管内皮细胞分离培养观察 |
| 2.2 血管内皮细胞鉴定 |
| 2.3 MTT检测细胞增殖 |
| 3 讨论 |
四、人脐静脉内皮细胞的分离培养与鉴定（论文参考文献）
- [1]胚胎干细胞向内皮（祖）细胞分化与组织来源内皮细胞的比较[D]. 刘倩. 山西大学, 2020(01)
- [2]韭根挥发油对人脐静脉内皮细胞糖萼层作用及其机制研究[D]. 袁杨. 兰州大学, 2020(01)
- [3]外源精胺对猪脐静脉内皮细胞血管形成的影响及其作用机理[D]. 赖涛. 江西农业大学, 2019(03)
- [4]人脐静脉内皮细胞培养技术的研究进展[J]. 白雪晶,冯磊,徐文波,罗旋,鄢东海. 吉林医学, 2018(05)
- [5]人脐静脉内皮细胞分离培养和鉴定[J]. 陈小翠,陈邦党,杨毅宁,周韵,刘芬,盖敏涛,陈清杰,马依彤. 细胞与分子免疫学杂志, 2016(03)
- [6]人脐静脉内皮细胞分离培养方法的建立及优化[J]. 马振华,张连杰,马艳琴. 山西农业大学学报(自然科学版), 2015(03)
- [7]miR-206对婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖的影响及作用机制的研究[D]. 张培培. 第二军医大学, 2015(07)
- [8]人脐静脉内皮细胞的原代培养和鉴定[J]. 戴青原,谭小兵,赵昭,胡家丽,郭涛. 现代生物医学进展, 2013(28)
- [9]人脐静脉内皮细胞培养方法的改进[J]. 林敏华,陈子春,林宇涵,许双临,富显果. 现代预防医学, 2013(24)
- [10]犬脐静脉血管内皮细胞的分离培养与鉴定[J]. 胡泉,柴家科,刘玲英,侯玉森,王一贺,李百玲,杨红明. 中国修复重建外科杂志, 2013(04)