一、P-糖蛋白的融合表达研究（论文文献综述）
罗晓平[1]（2021）在《绵羊捻转血矛线虫耐药性调查及耐IVM候选基因的筛选与分析》文中进行了进一步梳理捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）作为全球分布且严重危害反刍动物的寄生虫之一,近年来在世界范围内对防控药物的耐药性不断加剧,给全球畜牧业造成重大经济损失。内蒙古作为我国肉羊主产区,生产模式正在向多元化转变,不同饲养模式下绵羊捻转血矛线虫感染状况及其对常用驱虫药物耐药现状是否一致还尚不清楚,尤其是捻转血矛线虫对伊维菌素耐药机理至今没有统一定论,已发现的耐药基因是否适用于国内现场虫株的耐药性检测知之甚少。为此,本论文从生产实际出发,首先开展内蒙古不同养殖模式下,绵羊捻转血矛线虫感染状况及其对常用驱虫药物的耐药性调查;在此基础上,对捻转血矛线虫耐伊维菌素虫株及敏感虫株进行了分离鉴定,并就分离株耐阿苯达唑情况及已报道的与伊维菌素耐药相关基因表达进行了分析;最后,通过现代分子生物学技术,筛选出了与捻转血矛线虫耐伊维菌素相关的新基因。上述研究内容为制定不同生产模式下捻转血矛线虫的防控策略提供了基础数据,同时也为研究国内捻转血矛线虫对常用驱虫药物的耐药机制提供了虫种资源,更为发现用于评估和检测捻转血矛线虫耐药新基因提供了理论依据。所取得的具体研究结果如下:（1）首先对绵羊胃肠道线虫感染情况进行了调查。结果表明:羊只所感染的优势线虫为捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）,其在纯舍饲条件下的牧场感染率为0;在纯放牧模式下,羊群捻转血矛线虫感染则最为严重,平均感染率达到了94.1%,且EPG≥1000的羊只平均占比达到了24.1%;而半舍饲模式下羊群感染状况则介于两者之间,感染率为27.0%～100%,EPG≥1000的羊只平均占比为12.9%。其次,通过粪便虫卵减少试验,了解了纯放牧及半舍饲模式下捻转血矛线虫对常用驱虫药的耐药现状,结果显示,85.7%的群体对伊维菌素耐药;75.0%的群体对阿苯达唑耐药;但60.0%的群体对氯氰碘柳胺钠敏感;且部分种群对伊维菌素和阿苯达唑呈现双重耐药现象。上述结果为筛选适用于本地捻转血矛线虫防控的敏感高效驱虫药物和制订不同防控方案及兽医临床用药指导提供了依据。（2）针对本地区捻转血矛线虫耐药性严重的问题,为进一步弄清已报道基因是否适用于现场虫株的耐药性检测,采用国际通用方法,开展了国内捻转血矛线虫耐伊维菌素虫株的分离,并对其耐药程度进行了分析,结果成功分离到了3个对伊维菌素和阿苯达唑双重耐药的虫株及1个敏感虫株。其中编号为WSHc-001、WSHc-003及CYHHc-136虫株对伊维菌素的耐药比率分别为5.82、26.00和11.26;对阿苯达唑的EC50值均大于0.1μg/m L,鉴定为双重耐药株。编号为YCHc-022虫株对伊维菌素的耐药比率仅有0.89,阿苯达唑的EC50值则小于0.1μg/m L,为双重敏感虫株。其次,通过直接测序技术,对上述分离虫株的Ⅰ型β微管蛋白基因多态性进行分析,结果显示:所有耐药分离株种群内有超过10%的个体携带198位点纯合耐药基因型;有超过10%的个体在198位点和200位点同时存在杂合子基因型。而在敏感分离株中,这2个指标均低于10%。最后,采用RT-q PCR方法,对捻转血矛线虫各分离株P-gps基因的表达情况进行了检测,结果表明:对不同虫株间比较而言:在未用药刺激情况下,国际耐伊维菌素虫株中的P-gp1、P-gp2、P-gp3、P-gp11及P-gp12基因表达均较国际敏感虫株显着升高;但对于现场分离的耐药虫株而言,只有P-gp1和P-gp11的表达量较国际敏感虫株显着升高;而P-gp2、P-gp3、P-gp9及P-gp12较国际敏感虫株表达量显着下调。使用药物刺激后,与国际敏感虫株相比,各耐药虫株只有P-gp12在药物刺激后显着升高,其余几种P-糖蛋白则没有统一的变化规律。对同一虫株用药前后比较,发现在国际虫株和分离虫株之间存在明显的表达差异。该研究成果证实了利用现有耐药性标记分子在进行不同地理环境下的捻转血矛线虫耐药性检测时,其结果会有所差异。（3）为筛选适用于捻转血矛线虫耐伊维菌素检测的新基因,采用基于2b-Rad测序技术的全基因组单核苷酸多态性（SNP）分析方法,以捻转血矛线虫国际耐药虫株和敏感虫株作为研究对象,在基因组中筛选潜在的与捻转血矛线虫耐伊维菌素相关的基因。最终,获得了9个可能具有伊维菌素定向选择特征的基因,其中7个可能编码一些耐药相关功能蛋白。进一步采用PCR直接测序技术对筛选出的3个耐伊维菌素候选相关基因的单核苷酸多态性进行了验证。结果分析并确定了1个捻转血矛线虫耐伊维菌素相关候选功能基因HCOI00506600及1个可作为伊维菌素耐药性诊断的候选标记分子HCOI01200700;也证实了基于2b-Rad测序技术的全基因组单核苷酸多态性分析方法在开展捻转血矛线虫耐药性候选基因筛选中的有效性。
曹雨虹[2]（2021）在《P-糖蛋白潜在抑制剂高效筛选方法的建立及其体内外评价研究》文中指出多药耐药（Multidrug resistance,MDR）是一种严重的肿瘤细胞耐药现象,是化疗失败的重要原因。P-糖蛋白（P-Glycoprotein,P-gp）为最早被发现的ABC转运蛋白,肿瘤细胞P-gp过表达是发生MDR的常见机制之一,会导致临床化疗的失败。抗癌药物与P-gp抑制剂的联合使用可提高肿瘤细胞当中化疗药物的累积,从而提高化疗药物的治疗效果,实现逆转MDR。目前P-gp抑制剂已开发至第三代,因严重毒副作用而止步于临床前或临床研究。因此,开发高选择性、低毒副作用的P-gp抑制剂,对逆转肿瘤治疗中P-gp所介导的MDR具有重大意义。中药（Traditional Chinese Medicine,TCM）具有化学结构新颖,毒性较小等优点,是P-gp抑制剂筛选重要来源。目前小分子与P-gp之间的相互作用研究主要停留于细胞层面,实验手段耗时费力,且准确性有限,缺少精确快速的筛选方法。另外,对于P-gp抑制剂的评价还停留在体外阶段,体内研究相对较少。针对P-gp抑制剂筛选所面临的问题,本论文以P-gp为研究核心,运用多种膜蛋白稳定策略,获得构象正确且活性良好的P-gp蛋白,结合表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance,SPR）技术专属性高及快速等优点,建立P-gp抑制剂高效筛选新方法以及从体外到体内的潜在抑制剂与P-gp相互作用评价体系。本课题研究内容主要分为以下三个部分:1、基于慢病毒载体膜蛋白稳定策略结合SPR的中药P-gp潜在抑制剂筛选方法的建立将慢病毒（Lentiviral particles,LVP）稳定膜蛋白策略与SPR技术相结合,构建P-gp特异性配体筛选系统,从TCM中筛选P-gp潜在抑制剂,进行体外验证其生物学活性。首先,构建了不同P-gp表达水平的慢病毒颗粒,并鉴定了慢病毒上P-gp的表达。然后,将P-gp高低表达的慢病毒颗粒固定在CM5芯片的不同通道上进行亲和力检测。测定了阳性药Valspodar和环孢素（Cyclosporine A,Cs A）与芯片上P-gp之间结合的KD值分别为14.09μM和16.41μM。采用此筛选系统从40种中药单体中筛选出3个化合物为潜在的P-gp配体。亲和力实验表明,厚朴酚、和厚朴酚、白藜芦醇与芯片上P-gp结合的KD值分别为15.88,6.44和70.01μM。随后进行体外验证实验,罗丹明123（Rhodamine 123,Rh123）双向转运实验表明,这3个化合物均能抑制Rh123的外排。此外,和厚朴酚和白藜芦醇可将Adr对MCF-7/ADR细胞的IC50值由17.54±4.54μg/m L分别降低至9.56±0.60μg/m L和8.00±1.60μg/m L,表明这两种化合物具有逆转MCF-7/ADR细胞MDR的活性。蛋白印迹（Western blot,WB）和流式细胞仪分析结果表明,厚朴酚与和厚朴酚均能下调耐药癌细胞中P-gp的表达水平。本实验基于慢病毒膜蛋白稳定技术结合SPR生物传感器构建了一种新型P-gp配体筛选系统,以慢病毒作为P-gp的载体,可保持其天然构象,方法专属性较强,用于体外研究小分子与P-gp的相互作用。相较于传统细胞实验筛选,大大缩短了实验时间。2、SMA聚合物萃取细胞膜蛋白策略结合SPR建立P-gp潜在抑制剂快速筛选新方法研究应用苯乙烯马来酸聚合物（Styrene-co-maleic acid,SMA）膜蛋白稳定策略,将P-gp固定在其内源性的脂质环境当中,结合SPR技术建立快速筛选P-gp潜在抑制剂方法。首先,以正常乳腺癌细胞MCF-7和耐阿霉素（Adriamycin,Adr）的乳腺癌细胞MCF-7/ADR为模型,采用SMA聚合物技术从细胞膜当中萃取出膜蛋白,获得相应的蛋白脂质体（SMA lipid particles,SMALPs）。同时对SMA聚合物萃取膜蛋白前处理方法进行了优化,并对筛选系统进行方法学考察,包括脂质体稳定性、芯片饱和性、芯片特异性及SMA聚合物对筛选结果的干扰。实验结果表明,SMA聚合物前处理最佳条件为细胞膜超声破碎20 s,反应时间4 h,膜浓度为40 mg/m L,阳性药Valspodar与芯片结合KD值为26.12μM,表明芯片具有良好特异性。芯片中脂质体稳定性为24 h,且样品中残留的SMA聚合物对测试结果无干扰。将SMALPs偶联至L1芯片的不同通道上进行亲和力检测,由此构建P-gp潜在抑制剂筛选体系（P-gp-SMALP-SPR）。应用此筛选系统从50种中药单体中筛选出9个单体成分作为目标化合物,并对它们进行体外生物活性验证。结果发现粉防己碱、防己诺林碱、白花前胡乙素、黄芩新素和淫羊藿素可以显着降低Adr对MCF-7/ADR细胞的IC50值。其中粉防己碱,白花前胡乙素和黄芩新素可通过抑制P-gp的功能逆转P-gp所介导的多药耐药。本实验所建立的筛选系统专属性较强,可实现快速筛选P-gp潜在抑制剂,大大缩短了筛选时间,筛选得到的白花前胡乙素和黄芩新素均为首次报道具有逆转MDR活性。3、P-gp潜在抑制剂逆转肿瘤多药耐药活性的体内评价-以粉防己碱为例目前P-gp潜在抑制剂体内研究较少,体内药效、药物相互作用以及毒理学特性数据缺乏。粉防己碱（Tetrandrine,TET）是由P-gp-SMALP-SPR筛选系统得到的P-gp潜在抑制剂,细胞活性实验证实,TET可将Adr对MCF-7/ADR细胞的IC50值由86.09±4.74μM降至13.52±0.63μM,在筛选得到的9个小分子中,体外逆转MDR活性最高。在体内对TET逆转MDR活性进行评价,采用MCF-7/ADR细胞构建小鼠移植瘤模型,应用联合给药方式,通过瘤体重量与体积比较P-gp潜在抑制剂TET联合紫杉醇（Paclitaxel,PTX）治疗MCF-7/ADR移植瘤的效果,得到PTX单独给药对肿瘤小鼠的抑瘤率为42.34%,TET单独给药组抑瘤率为61.03%,PTX和TET联合用药抑瘤率为82.44%,是单独给抗癌药PTX的2倍。建立LC-MS/MS法对血浆及肿瘤组织中的PTX进行测定,比较TET对PTX在小鼠血浆及肿瘤中分布的影响,从而对TET逆转P-gp介导的肿瘤MDR进行综合评价。结果显示血浆和肿瘤组织LC-MS/MS方法专属性良好,日内和日间精密度RSD值均小于15%,基质效应RSD值小于15%,基质对PTX的测定无影响。TET联合PTX给药后,肿瘤当中PTX的累积量由17.51±8.46（ng/g）增加至141.75±70.15（ng/g）,表明TET可提高PTX对耐药人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制效果,同时TET联合用药不会提高抗癌药PTX在血浆当中的浓度。通过小动物活体成像对瘤体中PTX的分布进行监测,结果均表明TET增加了PTX在耐药肿瘤中的累积和分布。本实验从瘤体大小与重量、PTX的血药浓度以及PTX在肿瘤组织当中的累积量和分布的改变三个层面建立了P-gp潜在抑制剂逆转肿瘤MDR活性的体内评价体系。
刘黎黎[3]（2021）在《基于机器学习和集成方法预测化合物的血脑屏障渗透性的研究方法》文中指出血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）作为吸收的一部分,通过将大脑组织与血液分开来保护中枢神经系统。近年来,BBB渗透性已成为化学吸收、分布、代谢和排泄（ADME）预测中的关键问题。传统实验既昂贵又费时,并且成为了大分子文库高通量筛选的主要瓶颈。如今,已经开发出各种计算机模拟预测模型,这些模型可以帮助我们过滤和预测化合物所需的ADMET特性。集成学习所获得模型的预测性能要优于基本分类器的预测性能。因此,为了提高性能,我们建立了集成模型来预测化合物的BBB渗透性。在这项研究中,使用3种机器学习算法和9种分子指纹开发了计算机集成模型来预测BBB的渗透性,并且采用少数类过采样技术（synthetic minority oversampling technique,SMOTE）处理了数据不平衡问题。在五折交叉验证中,Ensemble Top-9模型获得了最佳的预测性能,平均准确率（ACC）为0.930,AUC（受试者工作特征曲线（ROC）下方的面积）为0.966,敏感性（SEN）为0.964,特异性（SPE）为0.839;在外部验证集中的AUC为0.849,ACC为0.784,SEN为0.812,SPE为0.712。该模型对于新分子可能具有很高的预测性能,可用于中枢神经系统药物的早期筛选。由于P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）在BBB中高水平表达,它阻止潜在的中枢神经系统药物进入中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）。因此,我们用3种机器学习算法和9种分子指纹建立并检测了预测P-gp底物和抑制剂的集成模型,来判断药物是否为P-gp底物或抑制剂。其中对于P-gp底物的预测,最好模型是Ensemble Top-5,其在五折交叉验证中的AUC为0.840,ACC为0.759;在外部测试集验证中AUC为0.838,ACC为0.760。对于P-gp抑制剂的预测,最好模型是Ensemble Top-9,其在五折交叉验证中的AUC为0.918,ACC为0.849;在外部测试集验证中AUC为0.835,ACC为0.782。集成模型的AUC和ACC高于以同样训练集建立的基分类器模型,说明集成学习方法可以提高模型的预测性能。与近年来文献中报道的P-gp底物和抑制剂预测方法相比,我们最佳的集成模型获得了较高的AUC和ACC。综上所述,本研究的创新之处主要有两个方面:（1）采用了更加严格的条件对研究中使用的数据集去除重复（删除立体异构的重复）;（2）同时构建了三种预测的分类模型（化合物血脑屏障渗透性模型、P-gp底物模型和P-gp抑制剂模型）,更加仔细的探索了化合物的血脑屏障渗透性,所得到的模型性能较高且稳定。
周雯婷[4]（2020）在《知母多成分的体内外跨膜转运机制与脑部分布研究》文中提出中药知母（Anemarrhenae Rhizoma）为百合科植物知母的干燥根茎,是一种已被收录在《中国药典》中的具有清热泻火,滋阴润燥等作用的着名传统中草药。知母主要含一系列皂苷和黄酮类成分。现代药理学研究表明,它具有抗肿瘤、抗炎、解热、抗糖尿病、抗抑郁、抗血小板聚集和抗衰老、改善学习记忆等多种活性。知母及其提取物能显着改善AD模型动物的学习和记忆能力,具有与治疗AD相关的胆碱酯酶的抑制活性;此外,它还能通过增强胆碱能神经元的功能来减少A?的沉积,改善因长期胆碱能退变而造成的记忆缺陷。因此,知母常出现在临床治疗AD的处方中。然而,知母治疗AD的机制尚未明确,其活性成分跨器官屏障转运的情况也尚且未知。因此,本文围绕知母多种活性成分进行了以下三个方面的研究:1、基于体外Caco-2细胞模型的知母多成分跨膜转运研究目的:探讨知母多成分跨肠道转运机制,阐明知母成分与转运蛋白间的关系。方法:利用Caco-2细胞建立单层细胞肠道吸收模型,并对其结构和功能进行评价。选择合适浓度的知母多成分即知母皂苷AIII、知母皂苷BII、芒果苷、异芒果苷、新芒果苷、宝藿苷I、菝葜皂苷元进行跨膜转运实验,通过所建立的知母7种成分高效液相色谱串联三重四级杆质谱（HPLC-QQQ/MS）定量方法检测上述多成分在细胞转运样品中的含量,从而分析各目标成分跨肠吸收屏障的转运情况。结果:采用Caco-2细胞建立肠吸收屏障模型的单层细胞膜电阻值TEER为552Ω·cm2,荧光素钠的渗透系数为（0.28±0.04）×10-6 cm/s;P-gp抑制剂酮康唑可以抑制罗丹明123在该模型中的外排,增加罗丹明123在该模型中的吸收。所建立的HPLC-QQQ/MS检测方法,专属性好,准确度和精密度均符合要求;跨膜转运结果表明,芒果苷、异芒果苷、新芒果苷、宝藿苷I、知母皂苷AIII、知母皂苷BII和菝葜皂苷元的Papp（AP-BL）分别为（8.524±1.706）×10-8、（40.758±5.872）×10-8、（102.807±17.238）×10-8、（18.884±1.587）×10-8、（44.087±1.413）×10-8、（10.041±0.791）×10-8和（32.018±4.633）×10-8cm/s,其中异芒果苷、宝藿苷I、知母皂苷BII、菝葜皂苷元的外排率（ER）大于2,7种活性化合物分别与酮康唑配伍作用后,外排率（ER）均显着降低。结论:中药知母的活性成分异芒果苷、宝藿苷I、知母皂苷BII、菝葜皂苷元为P糖蛋白底物,芒果苷、新芒果苷、知母皂苷AIII在Caco-2细胞模型上的吸收可能为单纯的透细胞被动转运,其中新芒果苷吸收良好且不受P-gp抑制剂的影响。2、大鼠体内知母提取物多成分的药代动力学及P-糖蛋白对其影响的研究目的:探讨知母多成分在动物体内药代动力学特征以及P-糖蛋白对各成分体内过程的影响。方法:建立血浆中知母多成分的HPLC-QQQ/MS定量方法,采用蛋白沉淀法处理血浆样品,梯度洗脱,流速为0.300 m L/min,采用质谱多反应监测模式进行定量分析。16只大鼠随机均分为对照组和抑制剂组,抑制剂组大鼠口服灌胃酮康唑溶液（10 mg/kg,1 m L/200 g）,对照组大鼠口服灌胃生理盐水（1 m L/200g）,30分钟后,所有大鼠均灌胃知母提取物（60 g/kg,2 m L/200 g）。分别在灌胃知母提取液0.25 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12h、24 h、30 h、36 h后,按照给药顺序各收集8只对照组、8只抑制剂组大鼠的血样。通过测定血浆样品中知母各成分浓度,拟合其药代动力学参数,并评价P-gp抑制剂酮康唑对知母成分体内过程的影响。结果:血浆中HPLC-QQQ/MS方法7个成分的专属性良好,日内和日间精密度RSD均小于11%,基质效应为87.06-123.85%,稳定性符合要求;对照组大鼠血浆中能检测到除宝藿苷I外的其他6种成分,与对照组相比,抑制剂组大鼠血浆中能检测到包括宝藿苷I在内的全部7种成分;芒果苷和异芒果苷在大鼠体内吸收良好,AUC和Cmax值均较高;菝葜皂苷元的半衰期和消除时间在7种成分中最长,且在加入P-糖蛋白抑制剂酮康唑后其Tmax值显着延长。结论:芒果苷、异芒果苷和新芒果苷在大鼠体内吸收良好;知母皂苷BII吸收较好且为P-糖蛋白底物;知母皂苷AIII在大鼠体内吸收一般但消除时间较长;宝藿苷I为P-糖蛋白底物且口服给药生物利用度极低;菝葜皂苷元的跨肠道屏障受P-糖蛋白影响,推测也可能为P-糖蛋白底物。3、知母提取物多成分在大鼠脑部的分布研究目的:探讨知母多成分在动物体内跨血脑屏障转运至脑部分布情况。方法:通过给予正常SD大鼠灌胃知母提取液,按照60 g/kg（2 m L/200 g）的给药剂量对大鼠灌胃知母提取液后,于1 h、3 h、6 h、9 h以及24 h分别测定大鼠血浆和脑组织中知母成分的浓度,分析知母多成分跨BBB转运情况。结果:建立了脑组织中知母7种成分的HPLC-QQQ/MS定量方法,专属性、精密度和准确度、基质效应、稳定性符合要求。新芒果苷、知母皂苷BII、知母皂苷AIII和菝葜皂苷元可跨BBB向脑部转运,而芒果苷、异芒果苷跨BBB向脑组织转运量极少;与此同时,宝藿苷I在血液中无法检出,也不能跨BBB向脑组织转运;新芒果苷、知母皂苷BII和菝葜皂苷元在不同时间点的脑血比值不断上升,其中新芒果苷和菝葜皂苷元能迅速经血液吸收入脑,同时菝葜皂苷元在24 h时脑/血比达到147%,说明菝葜皂苷元能跨BBB屏障向脑部转运且吸收良好,而知母皂苷BII在9 h前脑血比值较小,24 h时增加了近十倍,说明其在脑部的药物代谢明显慢于血液中,推测其受P-糖蛋白的外排作用影响较大;而知母皂苷AIII的脑血比值在不同时间点没有显着性变化,说明其在脑部和血液中的消除速率基本一致。结论:新芒果苷、知母皂苷BII、知母皂苷AIII和菝葜皂苷元可跨BBB向脑部的转运,其中新芒果苷和菝葜皂苷元在脑部的吸收较快,菝葜皂苷元在脑部的消除速率明显低于血液中,知母皂苷BII跨BBB向脑部转运受P-糖蛋白外排作用的影响较大。综上所述,知母中异芒果苷、宝藿苷I、知母皂苷BII和菝葜皂苷元可能为P-糖蛋白底物;芒果苷和异芒果苷经口服给药后能迅速吸收入血,且生物利用度良好;新芒果苷、知母皂苷AIII、知母皂苷BII和菝葜皂苷元可跨BBB向脑部转运,其中新芒果苷和菝葜皂苷元入脑吸收较快,菝葜皂苷元的脑血比值最大,同时在血液和脑部的消除时间最长,推测可能为知母防治阿尔茨海默症的主要有效入脑成分。
陈昱初[5]（2019）在《脂筏成分量化与吸附性能关系研究》文中研究表明脂筏（Lipid raft）位于细胞膜上,且含有丰富的胆固醇、磷脂和靶蛋白,它是一种在低温下不溶于非离子去垢剂的微区结构。脂筏的成分和人类的疾病密切相关,参与信号转导和蛋白的转运,从而与肿瘤、糖尿病和老年痴呆症等疾病有关。脂筏色谱是基于亲和色谱和细胞膜色谱法原理,通过生物分子的特异亲和吸附,可同时对活性成分进行筛选、分离富集及结构的鉴定。目前构建的有单靶点和多靶点脂筏色谱,初步证明可以高效率高选择性地从复杂的中药中筛选出活性成分,过程快速简单,具有高度专一性,改善了传统中药提取时复杂耗时的情况,同时也延长了部分亲和色谱和细胞膜色谱的使用时间;但至今未有系统的制备和评价方法,仍然存在重复性差的问题。P-糖蛋白（P-gp）具有能把药物泵出细胞外的功能,成为肿瘤药耐药、药物生物利用度低的原因之一。越来越多的研究者投入到P-gp底物和抑制剂的体外筛选研究中。目前关于脂筏功能和亲和色谱的报道较多,但对于脂筏提取和表征方法的优化及脂筏成分含量的测定研究较少,对脂筏色谱的构建及吸附性能研究便少之又少。本文选取常用的去垢剂法和非去垢剂法从细胞中提取脂筏,分析比较不同提取方法对Caco-2细胞和U251细胞中脂筏成分的影响;对脂筏中的胆固醇和总蛋白进行了定量方法研究,以期使脂筏的研究走向定量化,可控化;构建富含Pgp蛋白的脂筏色谱,对脂筏固定相进行表征分析,并研究脂筏成分的含量与脂筏柱吸附性能的关系,考察脂筏色谱的吸附性能及其影响因素。为解决重复性差的问题提供借鉴和思考;同时为体外筛选与P-gp相互作用的成分提供依据;为活性成分的高效筛选和各类疾病新靶标的发现提供新的思路。第一章综述本章主要介绍了研究对象脂筏及脂筏色谱。首先对脂筏的定义、结构、功能及提取与表征的方法进行了归纳概括,为脂筏提取与表征的优化提供借鉴;同时对脂筏的成分研究进行了阐述,介绍了脂筏成分胆固醇、总蛋白、特征蛋白等的功能和作用,以及它们量化的方法;接着,又介绍了P-gp的生理功能及其底物和抑制剂体外筛选的方法;最后介绍了亲和色谱和脂筏色谱的原理和应用,以及亲和色谱机制及吸附性能的影响因素,以期为脂筏色谱的广泛应用提供借鉴和思考。第二章脂筏提取与鉴定本章进行了Caco-2细胞和U251细胞的培养,采用不同方法提取脂筏并进行表征比较。通过去垢剂法1、去垢剂法2和非去垢剂法裂解Caco-2细胞和U251细胞,后采用蔗糖密度梯度离心法提取和收集脂筏。并以加入β-环糊精为阴性对照组,采用Western Blot、免疫荧光的方法对脂筏进行了表征。通过Western Blot法对脂筏特征蛋白caveolin-1和Flotillin-1,细胞的特征蛋白P-gp和Trka的表征确定了脂筏的层数,分析了不同方法对脂筏提取产生的影响。结果显示,不同方法提取脂筏的分层和脂筏中的蛋白表达情况不同:去垢剂法比非去垢剂法提取的脂筏量多且提取更充分,而去垢剂法2比去垢剂法1提取效果更好,脂筏层更多,目标蛋白P-gp表达更高。因此应根据实验需要及细胞特性,选择合适的提取方法。这为后续研究脂筏成分和构建脂筏色谱奠定了基础。第三章脂筏成分定量本章对不同方法提取的Caco-2细胞脂筏各层中总蛋白和两种细胞脂筏中的胆固醇进行了定量方法研究。总蛋白采用BCA（去垢剂兼容型）试剂盒法测定;胆固醇采用了高效液相和试剂盒的方法进行了定量方法研究。由蛋白含量可以看出:去垢剂法提取的脂筏蛋白总量比非去垢剂法多,被破坏脂筏结构的β-环糊精对照组蛋白含量最低;脂筏各层总蛋白含量与该层Flotillin-1和P-gp的表达规律呈现一致性。这不仅为脂筏提取条件的优化提供了量化的补充说明,同样也为探讨脂筏中蛋白含量分析提供了新的数据。胆固醇含量结果表明,高效液相法的样品前处理过程复杂易导致样品损失,使杂质峰多而样品峰小难以分辨;且初步发现U251细胞提取的脂筏中胆固醇含量略高于Caco-2细胞提取的脂筏中胆固醇含量。对脂筏成分的定量,以期使脂筏的研究走向量化和可控化,为脂筏成分的定量研究提供经验和参考。第四章脂筏色谱固定相制备及表征方法研究对脂筏与硅胶结合的方法和表征方法进行了探讨研究。采用课题组之前的静态吸附法结合,并摸索使用碳纳米管对硅胶进行改造的方法。采用免疫荧光、扫描电镜、能谱分析方法对固定相进行表征,对扫描电镜中制样的方法进行了详细的比较研究。同时,优化了固定相硅胶的种类及脂筏与硅胶结合的最佳比例。本章旨在制备和优化脂筏色谱固定相,为促进脂筏色谱更好的应用提供前提条件。第五章脂筏色谱构建及吸附性能评价本章构建了富含P-糖蛋白的Caco-2细胞脂筏色谱模型,以维拉帕米为阳性药物进行了脂筏色谱的吸附性能评价。研究脂筏成分的含量与脂筏柱吸附性能的关系,确定了脂筏与硅胶结合的比例,同时考察了脂筏色谱的专属性、稳定性和使用时限。对影响脂筏色谱吸附性能的因素进行了考察,对流动相的组成,流速,温度等进行了进一步研究。确定了用去垢剂法2提取的脂筏,本文制备条件下,脂筏与硅胶结合的比例为1:1较好,进行装柱制备富含P-gp蛋白的脂筏色谱模型效果更好,且本法制备的脂筏色谱柱具有良好的专属性、3个月内吸附性能稳定,连续使用200个小时后依旧保持良好的吸附性能。最终确定了色谱条件为:流动相为10 mmol/L的乙酸铵（PH7.2-7.4）、流速为0.3 mL/min、温度为37℃。
向敏[6]（2017）在《外源化合物对棉铃虫P-gp和Atg8基因的诱导表达》文中提出棉铃虫（Helicoverpa armigera Hubner）是一种危害广泛的世界性的重要害虫。化学防治是害虫治理的一项重要措施,随着杀虫药剂的大量使用,已有研究表明棉铃虫对多种杀虫药剂产生不同程度的抗性。目前关于抗药性的研究主要集中于解毒代谢的改变和分子靶标的变异,但是杀虫药剂的许多靶标位于细胞膜上或细胞内,关于药剂如何穿透细胞膜以及害虫本身如何快速降低细胞内有毒物质的研究却相对很少。P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）是由多药耐药基因MDR1编码的一种跨膜糖蛋白,属于ABCB亚家族,通过消耗ATP主动将细胞膜内的有毒物质转运到细胞膜外,既保护组织免受外源性有毒物质和内源性代谢有毒物质的威胁,又一定程度上可以影响药物的吸收。细胞自噬（Autophagy）是细胞在自噬相关基因（Autophagyrelatedgene,Atg）的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程,普遍存在于所有细胞内,以维持细胞自身合成和降解的稳态,是生物体内十分重要的生物学现象之一。细胞自噬相关基因8（Autophagy related gene 8,Atg8）编码的蛋白是一种为自噬体膜形成所必需的泛素样的小蛋白,在控制自噬体膜延伸方面发挥着重要作用,也常用来作为自噬发生的一个鉴定标志。利用高通量转录组测序的方法得到了棉铃虫转录组文库,利用表达谱测序得到了棉铃虫不同发育阶段的表达文库和2-十三烷酮处理前后的数字基因文库。再通过生物信息学分析,筛选出了一条编码多药耐药相关蛋白（Multidrug resistant associate protein,MRP）基因。运用RACE基因克隆方法得到了棉铃虫P-糖蛋白基因的全序列4054bp,其开放阅读框总共编码1253个氨基酸,预计蛋白大小约137 kDa。运用荧光定量分析表明P-糖蛋白在整个发育阶段的表达中,在四龄幼虫时表达最高;在不同组织的定位表达中发现P-糖蛋白基因在头部组织和脂肪体组织中表达量高于其他组织。之后,分别用10 mg/g的2-十三烷酮、40 μg/g的阿维菌素、10μg/g的溴氰菊酯、LC10和LC90的氯虫苯甲酰胺诱导棉铃虫六龄幼虫,利用荧光定量明确P-糖蛋白的表达。在2-十三烷酮处理组中,诱导12 h后P-糖蛋白的表达量达到顶峰,之后在24 h时出现下降,在48 h表达趋于对照水平;在组织诱导表达中,发现P-糖蛋白在中肠中表达量最高。在阿维菌素处理组中,头部、脂肪体和中肠中P-糖蛋白的表达都是逐渐升高,且在48h表达量最高;而在体壁中P-糖蛋白的表达是逐渐降低,12h表达量最高,24 h后明显下降。在溴氰菊酯处理组中,P-糖蛋白在12 h表达量最高,且在四个组织中中肠的表达量最高;在48 h表达量相对最低。在LC10氯虫苯甲酰胺处理组中,P-糖蛋白表达量在24h出现最低值,48h表达量最高;在组织诱导表达中,P-糖蛋白在中肠和脂肪体表达量相对较高,而体壁表达量最低并且几乎不变。在LC90氯虫苯甲酰胺处理组中,P-糖蛋白在12 h表达量相对最高,在48 h表达量相对最低;在组织诱导表达中,P-糖蛋白在体壁中表达量最高,在中肠中表达最低。利用免疫组化研究同样发现,2-十三烷酮和阿维菌素都可以诱导P-糖蛋白在棉铃虫细胞中表达增加。运用RNAi干扰P-糖蛋白基因发现,相对对照组,棉铃虫死亡率显着升高。通过克隆棉铃虫Atg8基因全长cDNA序列为727 bp,其开放阅读框总共编码117个氨基酸,预计蛋白大小约1.39kDa,pI值为8.73。运用荧光定量分析表明Atg8在整个发育阶段的表达中,成虫的表达量最高;在组织的定位表达中,头部表达量最高。之后,分别用10 mg/g的2-十三烷酮、40 μg/g的阿维菌素、10μh/g的溴氰菊酯、LC10和LC90的氯虫苯甲酰胺诱导棉铃虫六龄幼虫,利用荧光定量观察Atg8的表达。在2-十三烷酮处理组中,Atg8在四个组织中的表达在24 h达到峰值。在阿维菌素处理组中,Atg8的表达是逐渐升高,且在四个组织中的表达在48 h达到峰值。在溴氰菊酯处理组中,头部、脂肪体、中肠中Atg8的表达量在24 h达到峰值,但是在体壁中的表达却和对照组差异不大。在LC10氯虫苯甲酰胺处理组中,Atg8的表达量在处理后24 h达到峰值,且在体壁和中肠的表达量较高。在LC90氯虫苯甲酰胺处理组中,Atg8表达量在24 h达到峰值,且在脂肪体中表达量最高。运用RNAi干扰Atg8基因,结果发现相比对照组,棉铃虫死亡率显着升高。本文从P-糖蛋白和自噬相关基因8这两方面研究不同外源有毒化合物对棉铃虫P-gp和Atg8的诱导表达作用,结果表明P-gp和Atg8对外源有毒物质的耐药性发挥了重要的作用,从一个新的角度阐明了昆虫的抗药性机制,为揭示害虫的多抗性机制提供新的思路。
李晶晶[7]（2016）在《芹菜素逆转HCT116/L-OHP细胞耐药性及其机制研究》文中提出化疗是治疗结肠癌的一种非常重要的手段,然而细胞耐药性经常导致化疗失败。因此找到一种耐药逆转剂就具有重大意义。芹菜素是天然黄酮类化合物,能够抑制P-gp、bcl-2表达,抑制肿瘤细胞的生长。本实验希望阐明芹菜素对结肠癌HCT116/L-OHP细胞耐药逆转作用及其相关机制。采用MTT法测定芹菜素对细胞增殖的抑制作用,并得到无毒剂量（即抑制率低于10%的浓度）;通过奥沙利铂与无毒剂量的芹菜素联用,MTT实验测定芹菜素耐药逆转作用;应用流式细胞术测定敏感组,耐药组,耐药芹菜素组,耐药维拉帕米组中罗丹明123的蓄积情况;流式细胞术检测耐药组,耐药L-OHP组,联用组中细胞的凋亡率;实时荧光定量PCR检测敏感组,耐药组,耐药芹菜素组中P-gp,bcl-2的mRNA表达水平;Elisa法检测敏感组,耐药组,耐药芹菜素组中的P-gp、p-Akt、p-IκBα、IκBα、bcl-2、bax、caspase-3蛋白表达水平。实验结果表明:芹菜素给药24、36、48小时的无毒剂量分别为90、50、40μmol/L;芹菜素给药24、36、48小时的逆转指数分别为1.33、1.51、2.06;与耐药组相比,耐药芹菜素组中罗丹明123蓄积量明显增加（p<0.01）;与耐药L-OHP组相比,联用组的凋亡率明显上升（p<0.05）;与耐药组相比,耐药芹菜素组P-gp、bcl-2基因mRNA表达水平明显降低（p<0.01）;与耐药组相比,耐药芹菜素组的P-gp、p-Akt,p-IκBα、bcl-2蛋白表达水平降低,bcl-2/bax值减少,IκBα、caspase-3蛋白表达水平明显提高（p<0.05-0.01）。芹菜素40μmol/L给药48h具有最佳的逆转作用,逆转指数2.06,其逆转机制可能与抑制P-gp的功能,下调P-gp、bcl-2蛋白表达,上调bax、caspase-3蛋白的表达水平,启动caspase级联反应,提高细胞的凋亡率相关。
乌洪芳[8]（2015）在《初步探讨P糖蛋白在黄连素调节胰岛素分泌机制中的作用》文中认为目的黄连素作为降糖药物对胰岛β细胞所起的调节作用是多方面,本研究初步探讨黄连素通过影响P糖蛋白表达调节胰岛素分泌的潜在机制。方法（1）体外培养大鼠胰岛素瘤细胞株832/13 INS-1细胞（简称832/13细胞）;（2）用不同浓度（1uM、5uM、10uM、20uM）的黄连素干预细胞72小时,萃取细胞膜蛋白,以Western Blot技术检测P糖蛋白、胰岛素分泌相关膜蛋白和凋亡相关蛋白表达的变化,包括小窝蛋白1（caveolin-1）、L型钙离子通道（L-type calcium channel protein,Cav1.3）、Bcl-2 和 Caspase-3;（3）用上述不同浓度的黄连素干预细胞72小时后进行高糖刺激胰岛素分泌试验（glucose stimulated insulin secretion,GSIS）,应用放免法测定胰岛素细胞内含量和细胞外分泌量;（4）依照P糖蛋白调控基因abcb1a及abcb1b分别设计RNAi序列下调832/13细胞中P糖蛋白的表达;提取细胞总RNA,应用实时定量PCR检测细胞abcb1a及abcb1bmRNA表达量的变化;萃取832/13细胞膜蛋白,应用Western blot检测P糖蛋白表达量、胰岛素分泌相关蛋白和凋亡相关蛋白表达量的变化;（5）放免法测定RNAi下调P糖蛋白后细胞内胰岛素含量以及GSIS的变化。结果（1）黄连素干预细胞72h后,Western Blot显示不同浓度黄连素对细胞凋亡蛋白Bcl-2及Caspase3的表达均未产生显着影响（P>0.05）;在干预浓度为5uM、10uM时,L型钙离子通道Cav1.3表达明显增加（P<0.01）;在干预浓度为1uM、5uM、10uM时,P糖蛋白及Caveolin1表达明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）黄连素干预没有对细胞内胰岛素含量产生显着影响;（3）GSIS实验中,不同干预浓度下各组之间基础胰岛素分泌量（basal insulin secretion,BIS）没有明显的变化,但是在干预浓度为5uM、10uM时高糖刺激下的胰岛素分泌显着增高（P<0.01）;（4）RNAi转染细胞48小时后,显微镜下可见超过90%的832/13细胞呈现红色荧光,表明转染效果满意;（5）实时定量PCR探测结果显示abcb1a和abcb1b的mRNA表达量被其相对应的RNAi明显下调,同RNAi阴性对照组相比具有统计学意义（分别为P＜0.05和P＜0.01）;Western blot结果表明P糖蛋白表达量被abcb1b静默序列显着下调,而abcb1a静默子对P糖蛋白表达量影响与阴性对照相比没有统计学差异;P糖蛋白表达量下调后,细胞Cav1.3及Caveolin1蛋白表达量也出现下调,同RNAi阴性对照相比具有统计学意义,显示了上述3种脂筏的表达呈现正相关性（分别为P＜0.01和P＜0.05）;凋亡蛋白Bcl-2及Caspase3蛋白表达在RNAi干扰组中均无明显差异（P>0.05）;（6）在GSIS试验中,abcb1b静默组BIS相比阴性对照组明显增加（P＜0.05）,而GSIS明显减少（P<0.05）;胰岛素合成总量在各组无明显变化（P>0.05）。结论（1）在干预浓度为1uM～10uM范围内,黄连素可以增加GSIS的分泌,但对基础胰岛素分泌无明显影响;（2）不同浓度的黄连素干预下凋亡蛋白表达及胰岛素合成总量未见明显变化,提示细胞凋亡和胰岛素合成不是黄连素调节胰岛素分泌的主要原因;在黄连素干预浓度为1uM～10uM范围内,P糖蛋白表达明显增加,提示P糖蛋白参与黄连素调节胰岛素分泌过程的可能性。另外,胰岛素分泌相关的蛋白（Cav1.3、Caveolin1）表达量明显增加,提示P糖蛋白调节GSIS的潜在机制与“脂筏”相关（P糖蛋白、Cav1.3、Caveolin1均为脂筏结构中的重要蛋白）;（3）RNAi实验中,实时定量PCR印证了我们的前期发现,即abcb1b为胰岛β细胞P糖蛋白的主要编码基因;（4）P糖蛋白表达下调时增加基础胰岛素分泌以及减少高糖刺激下胰岛素分泌,其中的调节网络可能涉及了 Cav1.3、Caveolin1等脂筏相关蛋白;（5）P糖蛋白表达下调时,凋亡蛋白及胰岛素合成总量未见明显变化,提示细胞凋亡和胰岛素合成不是P糖蛋白调节胰岛素分泌的主要原因;（6）综合两部分实验,我们推测黄连素对胰岛素分泌的影响可能是通过P糖蛋白、Cav1.3、Caveolin1相互之间的作用而引起的,其中P糖蛋白可能是这一调控网络的核心,具体机制有待于进一步证明。
申翔[9]（2014）在《大鼠胰岛beta细胞mini-P-糖蛋白及P糖蛋白表达的初步探究》文中进行了进一步梳理目的（1）对大鼠胰岛beta细胞中是否存在65kDa大小截短型P糖蛋白（mini-P糖蛋白）进行初步鉴定。（2）初步探究黄连素、环孢菌素A及阿霉素对大鼠胰岛beta细胞P糖蛋白表达的影响,从而为进一步研究P糖蛋白在胰岛素分泌中所起的调节作用提供依据。方法一、应用northern blottimg分析大鼠胰岛及INS-1细胞P糖蛋白mRNA的表达：（1）分离SD大鼠胰岛及培养INS-1细胞,分别提取组织/细胞总RNA。针对大鼠abcblb基因设计探针的引物序列,应用RT-PCR技术合成所需cDNA探针,纯化后应用罗氏地高辛标记与检测试剂盒（DIG DNA Labeling and Detection Kit, Roche）进行地高辛-dUTP标记,获得northern blotting检测探针。（2）大鼠胰岛及INS-1细胞RNA行甲醛变性凝胶电泳,经毛细管虹吸印迹法转移至尼龙膜上后120℃30min烘烤固定。（3）探针与胰岛及INS-1细胞RNA进行杂交。（4）应用罗氏试剂盒对杂交结果进行检测。二、应用western blotting在蛋白表达水平探究mini-P-糖蛋白的表达：（1）取6孔细胞培养板对数生长期的INS-1细胞,用裂解液按照蛋白提取试剂盒说明进行操作,分别在蛋白酶抑制剂“Protease Inhibitor Cocktail Tablets"（商品名：cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack Roche）和无蛋白酶抑制剂的条件下提取INS-1细胞蛋白。（2）BCA法测定蛋白浓度后行10%SDS-PAGE凝胶电泳分离目的蛋白,转膜、封闭、洗涤后用小鼠抗大鼠P糖蛋白特异性单克隆抗体C219（1：200）4℃孵育过夜,加HRP结合的山羊抗小鼠二抗（1：10000）室温孵育2h, TBST漂洗3次后ECL增强显色。三、 Real-Time PCR检测黄连素、环孢菌素A及阿霉素对abcbl基因表达的影响：分别应用黄连素（0.2μM,1μM,5μM,20μM）,环孢菌素A （O.1μg/mL）及阿霉素（50ng/mL）对INS-1细胞干预一周,提取每组细胞的总RNA后经RT-PCR逆转录为cDNA,应用Real-time PCR技术分别检测P糖蛋白调控基因（abcbl、 abcbla与abcblb）及凋亡相关基因（Bcl-2与caspase-3）的表达情况。结果（1） Northern blotting结果显示单条带,分子量大小约3.0kb。（2） Western blotting结果显示无蛋白酶抑制剂组仅有65kDa的"mini-P-糖蛋白”的表达,而在蛋白酶抑制剂保护组主要表达分子量为170kDa大小的全长P糖蛋白且"mini-P-糖蛋白”表达显着减低。（3）黄连素0.2μM、1μM,5μM组abcbla-N表达增高,差异具有统计学意义（P＜0.05）;环孢菌素A与50ng/mL阿霉素组所有基因表达差异均无统计学差异。结论（1）结合本研究northern blotting及western blotting结果初步认为前期在大鼠胰岛探测到的mini-P-糖蛋白并非MDR1/abcb1基因在mRNA水平上选择性剪切的结果,而可能为蛋白降解产物。（2）黄连素对P糖蛋白调控基因表达有影响,O.1μg/mL环孢菌素A与50ng/mL阿霉素对P糖蛋白相关基因表达影响不明显。
王慧[10]（2014）在《P-糖蛋白在神经细胞内的降解机制及其临床意义》文中研究表明P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）是一种ATP依赖性的跨膜转运蛋白，可以将多种结构和药效不同的化合物排出细胞，是产生多药耐药的主要原因之一。目前P-糖蛋白在多要耐药方面的研究主要集中在肿瘤及难治性癫痫的发生，其中肿瘤的发生是原癌基因的激活、抑癌基因的抑制、凋亡基因及修复基因的改变等多因素综合作用的结果，而P-糖蛋白的升高是癫痫发展为难治性癫痫的重要生物学基础，因此，P-糖蛋白在难治性癫痫中的作用机制研究尤为重要。目前关于P-糖蛋白基因调控及相应的信号传导通路成为P-糖蛋白的研究热点，但是P-糖蛋白处于不断的合成与降解的动态平衡，因此，从P-糖蛋白降解的角度揭示P-糖蛋白在多药耐药中的作用机制是一个新思路。目的研究神经细胞内P-糖蛋白的降解途径并探讨P-糖蛋白在神经细胞内降解对难治性癫痫治疗的临床意义。方法1.腺病毒作为载体，将ABCB1基因转染到U251细胞，建立高表达P-糖蛋白的细胞模型。2.在已建立的高表达P-糖蛋白的细胞模型上，不同浓度的特异性蛋白酶体抑制剂MG132、溶酶体抑制剂ChlQ处理细胞24h，同时设定时间依赖组。Western blot检测P-糖蛋白水平的变化情况，明确神经细胞内P-糖蛋白的降解途径。结果1.蛋白酶体抑制剂MG132处理组，P-糖蛋白在蛋白酶体抑制剂处理后表达明显升高，且P-糖蛋白表达随着MG132浓度的升高而升高。P-糖蛋白表达与蛋白酶体抑制剂处理时间无明显相关性，但是蛋白酶体抑制剂处理可以明显增加P-糖蛋白的表达。2.溶酶体抑制剂ChlQ处理组，P-糖蛋白的表达与对照组相比无明显异常，且不随溶酶体抑制剂浓度及处理时间变化而变化。结论1.神经细胞内P-糖蛋白的降解与溶酶体途径无关。2.神经细胞内P-糖蛋白的降解通过泛素-蛋白酶体途径。3.抑制泛素-蛋白酶体功能可以增加神经细胞内泛素化P-糖蛋白的含量，引起神经细胞内P-糖蛋白积聚。
二、P-糖蛋白的融合表达研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、P-糖蛋白的融合表达研究（论文提纲范文）
（1）绵羊捻转血矛线虫耐药性调查及耐IVM候选基因的筛选与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 内蒙古地区羊产业发展概况 |
| 1.2 捻转血矛线虫及捻转血矛线虫病概述 |
| 1.2.1 捻转血矛线虫分类地位 |
| 1.2.2 捻转血矛线虫生活史 |
| 1.2.3 捻转血矛线虫病及其危害 |
| 1.2.4 捻转血矛线虫病防控技术 |
| 1.3 常用驱捻转血矛线虫药物概述 |
| 1.3.1 伊维菌素(Ivermectin,IVM) |
| 1.3.2 阿苯达唑(Albendazole,ABZ) |
| 1.3.3 氯氰碘柳胺钠(Closantel Sodium) |
| 1.4 捻转血矛线虫对常用驱虫药物的耐药性研究 |
| 1.4.1 耐药性检测技术 |
| 1.4.2 捻转血矛线虫对伊维菌素的耐药性 |
| 1.4.3 捻转血矛线虫对阿苯达唑的耐药性 |
| 1.4.4 捻转血矛线虫耐驱虫药候选基因研究概述 |
| 1.5 2b-Rad技术及其应用 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 2 试验一绵羊捻转血矛线虫感染状况调查及对常用驱虫药的耐药性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 不同饲养模式下的绵羊捻转血矛线虫感染情况比较 |
| 2.2.2 剖解羊只后胃肠道线虫成虫检测结果 |
| 2.2.3 所选驱虫药有效成分检测结果 |
| 2.2.4 用药后不同采样时间点对常用驱虫药物耐药性检测结果的影响 |
| 2.2.5 纯放牧模式下的羊捻转血矛线虫对常用驱虫药耐药性情况 |
| 2.2.6 半舍饲模式下的羊捻转血矛线虫对常用驱虫药耐药性情况 |
| 2.3 讨论与小结 |
| 3 试验二捻转血矛线虫国内株的分离鉴定及耐药相关基因分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 对伊维菌素耐药捻转血矛线虫虫株分离结果 |
| 3.2.2 对伊维菌素敏感捻转血矛线虫虫株分离结果 |
| 3.2.3 不同分离虫株耐伊维菌素特性检测结果及比较 |
| 3.2.4 不同分离虫株耐阿苯达唑特性检测结果及比较 |
| 3.2.5 不同分离虫株特异性引物鉴定结果 |
| 3.2.6 不同分离虫株Ⅰ型β微管蛋白基因特异性位点SNP分析结果 |
| 3.2.7 不同分离虫株Ⅰ型β微管蛋白基因型及其频率分析结果 |
| 3.2.8 伊维菌素刺激前后不同分离虫株P-gps基因表达分析结果 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 4 试验三基于2b-Rad的捻转血矛线虫耐IVM候选新基因的筛选与分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 SNPs发掘及其分布特征结果分析 |
| 4.2.2 耐药与敏感虫株遗传多样性和种群分化结果分析 |
| 4.2.3 捻转血矛线虫耐伊维菌素相关候选基因筛选结果 |
| 4.2.4 HCOI00378500 基因测序及分析结果 |
| 4.2.5 HCOI00506600 基因测序及分析结果 |
| 4.2.6 HCOI01200700 基因测序及分析结果 |
| 4.3 讨论与小结 |
| 5 结论 |
| 6 本课题创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（2）P-糖蛋白潜在抑制剂高效筛选方法的建立及其体内外评价研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 一、课题研究背景 |
| (一)肿瘤多药耐药与P-糖蛋白 |
| (二)P-gp抑制剂逆转肿瘤多药耐药研究 |
| (三)P-gp抑制剂筛选方法的研究现状 |
| (四)表面等离子共振技术及其在中药活性成分筛选中的应用 |
| (五)P-gp膜蛋白稳定策略 |
| (六)中药与P-gp相互作用研究 |
| 二、课题研究思路与研究内容 |
| 第二章 基于纳米盘技术和慢病毒载体膜蛋白稳定策略结合SPR的中药P-gp潜在抑制剂筛选方法的建立 |
| 一、引言 |
| 二、实验部分 |
| (一)试剂与材料 |
| (二)仪器 |
| (三)细胞培养 |
| (四)蛋白定量 |
| (五)纳米盘技术稳定P-gp策略 |
| (六)慢病毒载体技术稳定P-gp策略 |
| (七)基于P-gp-LVP-SPR筛选体系的P-gp潜在抑制剂筛选 |
| (八)P-gp潜在抑制剂的体外活性验证 |
| 三、结果与讨论 |
| (一)Nanodisc-P-gp结合SPR分析系统的构建 |
| (二)慢病毒载体稳定P-gp策略结合SPR分析系统构建 |
| (三)应用P-gp-LVP-SPR分析系统从中药中筛选P-gp潜在抑制剂 |
| (四)P-gp潜在抑制剂体外活性验证 |
| 四、本章小结 |
| 第三章 SMA聚合物萃取细胞膜蛋白策略结合SPR建立P-gp潜在抑制剂快速筛选新方法研究 |
| 一、引言 |
| 二、实验部分 |
| (一)试剂与材料 |
| (二)仪器 |
| (三)细胞培养 |
| (四)聚合物SMA的制备 |
| (五)MCF-7及MCF-7/ ADR细胞膜的提取 |
| (六)聚合物SMA稳定P-gp策略 |
| (七)P-gp-SMALP-SPR筛选体系优化 |
| (八)应用P-gp-SMALP-SPR筛选体系从中药中筛选P-gp潜在抑制剂 |
| (九)P-gp潜在抑制剂的体外活性验证 |
| 三、结果与讨论 |
| (一)P-gp-SMALP-SPR筛选分析系统的建立 |
| (二)SMALPs形态表征 |
| (三)P-gp-SMALP-SPR筛选体系优化 |
| (四)应用P-gp-SMALP-SPR分析系统从中药中筛选P-gp潜在抑制剂 |
| (五)P-gp潜在抑制剂的体外活性验证 |
| 四、本章小结 |
| 第四章 P-gp潜在抑制剂逆转肿瘤多药耐药活性的体内评价研究-以粉防己碱为例 |
| 一、引言 |
| 二、实验部分 |
| (一)试剂与材料 |
| (二)仪器 |
| (三)细胞培养 |
| (四)动物实验 |
| (五)血浆及肿瘤组织样品中紫杉醇浓度的LC-MS/MS定量方法 |
| (六)MCF-7/ ADR移植瘤小鼠血浆及瘤体中紫杉醇浓度的测定 |
| (七)小动物活体成像分析瘤体中PTX分布 |
| 三、结果与讨论 |
| (一)联合用药对MCF-7/ ADR移植瘤的抑制效果 |
| (二)紫杉醇的LC-MS/MS定量方法建立与验证 |
| (三)粉防己碱对MCF-7/ ADR移植瘤小鼠紫杉醇血药浓度的影响 |
| (四)粉防己碱对MCF-7/ ADR移植瘤小鼠瘤体中紫杉醇累积量的影响 |
| (五)粉防己碱对MCF-7/ ADR移植瘤小鼠瘤体中紫杉醇分布的影响 |
| 四、本章小结 |
| 全文总结及创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 The Effects of Traditional Chinese Medicine on P-Glycoprotein Mediated Multidrug Resistance and Approaches for Studying the Herb–P-Glycoprotein Interactions |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间研究成果情况 |
| 致谢 |
（3）基于机器学习和集成方法预测化合物的血脑屏障渗透性的研究方法（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 0.1 选题背景及研究意义 |
| 0.2 主要内容和结构安排 |
| 第1章 国内外文献综述 |
| 1.1 机器学习方法概况 |
| 1.1.1 支持向量机 |
| 1.1.2 随机森林 |
| 1.1.3 极限梯度提升 |
| 1.1.4 集成学习 |
| 1.2 定量构效关系(QSAR)概况 |
| 1.3 化合物血脑屏障渗透性预测 |
| 1.4 P-糖蛋白底物和P-糖蛋白抑制剂血脑屏障渗透性预测 |
| 第2章 基于集成学习方法构建化合物血脑屏障渗透性预测模型 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验数据收集 |
| 2.2.1 化合物数据集 |
| 2.3 模型构建与评估方法 |
| 2.3.1 分子指纹的计算 |
| 2.3.2 特征选择 |
| 2.3.3 模型构建 |
| 2.3.4 模型性能评估 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 特征选择 |
| 2.4.2 基分类器预测性能 |
| 2.4.3 集成模型预测性能 |
| 2.4.4 基于文献报道的模型的比较 |
| 2.4.5 化合物血脑屏障渗透性相关的结构特征 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 基于集成学习方法构建P-糖蛋白底物和抑制剂的预测模型 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验数据收集 |
| 3.2.1 P-gp底物数据集 |
| 3.2.2 P-gp抑制剂数据集 |
| 3.3 模型构建与评估方法 |
| 3.3.1 分子指纹的计算 |
| 3.3.2 特征选择 |
| 3.3.3 模型构建 |
| 3.3.4 模型性能评估 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 特征选择 |
| 3.4.2 基分类器预测性能 |
| 3.4.3 集成模型预测性能 |
| 3.4.4 基于文献报道的模型的比较 |
| 3.4.5 P-gp底物和P-gp抑制剂相关的结构特征 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
（4）知母多成分的体内外跨膜转运机制与脑部分布研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1、研究背景 |
| 1.1 知母的主要成分与药理药效研究简介 |
| 1.2 知母对阿尔茨海默症的药效研究概况 |
| 1.3 知母有效成分药代动力学及跨膜转运机制研究 |
| 2.本课题的研究内容 |
| 第二章 基于体外Caco-2细胞模型的知母多成分跨膜转运研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 仪器与材料 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 知母药材提取 |
| 2.3.2 Caco-2 细胞转运样品中知母多成分LC-MS/MS定量方法的建立 |
| 2.3.3 Caco-2细胞模型的建立与评价 |
| 2.3.4 细胞模型的建立与评价标准 |
| 2.3.5 Caco-2细胞模型功能的验证 |
| 2.3.6 知母多成分对Caco-2细胞毒性实验 |
| 2.3.7 基于Caco-2细胞模型的知母多成分双向转运研究 |
| 2.3.8 参数计算 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 HPLC-MS/MS定量方法的建立与评价 |
| 2.4.2 不同浓度知母成分对细胞活性的影响 |
| 2.4.3 光学显微镜观测结果 |
| 2.4.4 模型细胞跨膜电阻值 |
| 2.4.5 碱性磷酸酶的活力测定 |
| 2.4.6 荧光素钠的通透系数 |
| 2.4.7 罗丹明123转运验证实验 |
| 2.4.8 知母多成分双向转运特性 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 大鼠体内知母提取物多成分的药代动力学与P-糖蛋白影响研究 |
| 3.1 引言 |
| 第一节 大鼠血浆样品中同时测定知母提取物多成分的LC-MS/MS方法的建立与验证 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 药品与试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.2.4 知母药材提取 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 色谱-质谱条件 |
| 3.3.2 标准溶液配制 |
| 3.3.3 血浆样品前处理 |
| 3.3.4 方法学验证 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 方法学验证 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 前处理方法优化 |
| 3.5.2 LC-MS/MS条件优化 |
| 3.6 小结 |
| 第二节 大鼠体内知母提取物多成分的药代动力学与P-糖蛋白影响研究 |
| 3.7 药代动力学研究 |
| 3.7.1 给药方案与样品采集 |
| 3.7.2 知母多成分含量测定及药代动力学研究 |
| 3.7.3 统计学处理 |
| 3.7.4 知母多成分的血药浓度和药-时曲线 |
| 3.7.5 知母多成分的药动学参数和统计分析 |
| 3.8 讨论 |
| 3.9 小结 |
| 第四章 知母提取物多成分在大鼠脑部的分布研究 |
| 4.1 引言 |
| 第一节 大鼠脑组织样品中同时测定知母提取物多成分的LC-MS/MS方法的建立与验证 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 药品与试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 标准溶液的配制 |
| 4.3.2 脑组织样品前处理 |
| 4.3.3 LC-MS/MS分析条件 |
| 4.4 方法学验证与结果 |
| 4.4.1 方法的专属性 |
| 4.4.2 定量下限,线性方程及线性范围 |
| 4.4.3 准确度及精密度实验 |
| 4.4.4 提取回收率和基质效应 |
| 4.4.5 稳定性 |
| 第二节 知母提取物多成分在大鼠脑部的分布研究 |
| 4.6 脑组织分布研究 |
| 4.6.1 给药方案与样品采集 |
| 4.6.2 知母多成分的血药浓度和脑组织浓度 |
| 4.6.3 知母多成分的脑血比和统计分析 |
| 4.7 讨论 |
| 4.8 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）脂筏成分量化与吸附性能关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 综述 |
| 1 脂筏研究进展 |
| 1.1 脂筏假说 |
| 1.2 脂筏结构与功能 |
| 2 脂筏提取与表征 |
| 2.1 提取方法 |
| 2.2 表征方法 |
| 3 脂筏成分和量化方法研究 |
| 3.1 脂筏成分概述 |
| 3.2 脂筏成分量化方法概述 |
| 4 脂筏亲和色谱概述 |
| 4.1 亲和色谱 |
| 4.2 脂筏色谱 |
| 4.3 亲和色谱机制研究 |
| 5 P-糖蛋白研究进展 |
| 5.1 P-糖蛋白简介 |
| 5.2 P-糖蛋白生理功能 |
| 5.3 P-糖蛋白底物和抑制剂研究 |
| 6 研究意义及创新点 |
| 第二章 脂筏提取与表征 |
| 1 本章概述 |
| 2 仪器与试剂 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 溶液配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养及扩增 |
| 3.2 脂筏提取 |
| 3.3 脂筏鉴定与表征 |
| 4 结果与讨论 |
| 4.1 细胞培养与扩增 |
| 4.2 脂筏鉴定与表征 |
| 4.3 脂筏提取方法优化 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 脂筏成分定量 |
| 1 本章概述 |
| 2 仪器和试剂 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 总蛋白含量测定 |
| 3.2 胆固醇含量测定 |
| 4 结果与讨论 |
| 4.1 脂筏中蛋白含量 |
| 4.2 胆固醇含量 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 脂筏色谱固定相制备及表征方法研究 |
| 1 本章概述 |
| 2 仪器和试剂 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 脂筏色谱固定相的制备 |
| 3.2 脂筏色谱固定相表征 |
| 3.3 脂筏与硅胶比例的确定 |
| 4 结果与讨论 |
| 4.1 免疫荧光 |
| 4.2 扫描电镜 |
| 4.3 硅胶种类选择 |
| 4.4 脂筏与硅胶结合比例的选择 |
| 4.5 能谱分析 |
| 4.6 碳纳米管修饰硅胶 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 脂筏色谱构建及吸附性能评价 |
| 1 本章概述 |
| 2 仪器和试剂 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 脂筏色谱构建 |
| 3.2 脂筏色谱吸附性能考察 |
| 3.3 影响色谱吸附行为的相关因素 |
| 4 结果与讨论 |
| 4.1 脂筏柱装填 |
| 4.2 脂筏色谱柱吸附 |
| 4.3 脂筏色谱性能评价 |
| 4.4 影响脂筏色谱吸附行为的因素考察 |
| 5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或完成的论文 |
（6）外源化合物对棉铃虫P-gp和Atg8基因的诱导表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉铃虫及其抗药性分析 |
| 1.2 P-糖蛋白 |
| 1.2.1 ABC转运蛋白超家族 |
| 1.2.2 P-糖蛋白概述 |
| 1.2.3 P-糖蛋白的研究现状 |
| 1.3 细胞自噬基因ATG8 |
| 1.3.1 概念 |
| 1.3.2 细胞自噬方式 |
| 1.3.3 细胞自噬的发生过程 |
| 1.3.4 细胞自噬相关基因与Atg8 |
| 1.3.5 鳞翅目昆虫中Atg8的研究 |
| 1.4 高通量转录组测序 |
| 1.4.1 概况 |
| 1.4.2 转录组测序分析 |
| 1.4.3 高通量转录组测序在鳞翅目昆虫中的研究 |
| 1.5 本研究的内容、目的及技术路线 |
| 第二章 棉铃虫转录组和2-十三烷酮诱导表达谱的建立与分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 棉铃虫及饲养方法 |
| 2.2.2 实验试剂和仪器 |
| 2.2.3 高通量转录组测序 |
| 2.2.4 表达谱测序 |
| 2.2.5 筛选出与2-十三烷酮有关的棉铃虫多药耐药相关基因和自噬基因 |
| 2.2.6 荧光定量验证差异表达基因 |
| 2.2.7 数据分析与统计 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 棉铃虫转录组的测序、组装及功能分析 |
| 2.3.2 棉铃虫转录组中MRP基因 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 P-糖蛋白在棉铃虫中的表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 棉铃虫及饲养 |
| 3.2.2 实验试剂和仪器 |
| 3.2.3 P-糖蛋白基因全长的克隆 |
| 3.2.4 P-糖蛋白基因分析与进化树分析 |
| 3.2.5 荧光定量PCR |
| 3.2.6 数据分析与统计 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 棉铃虫P-糖蛋白序列的克隆 |
| 3.3.2 棉铃虫P-糖蛋白进化树分析 |
| 3.3.3 棉铃虫P-糖蛋白在不同组织和不同发育阶段的表达规律 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 外源化合物诱导棉铃虫P-糖蛋白的表达 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 供试棉铃虫及饲养 |
| 4.2.2 实验试剂和仪器 |
| 4.2.3 生物测定 |
| 4.2.4 荧光定量PCR |
| 4.2.5 免疫组化 |
| 4.2.6 RNAi棉铃虫P-糖蛋白基因 |
| 4.2.7 数据统计与分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 不同外源化合物诱导棉铃虫P-糖蛋白在组织中的表达 |
| 4.3.2 2-十三烷酮或阿维菌素诱导棉铃虫P-糖蛋白的免疫组化 |
| 4.3.3 干扰棉铃虫P-糖蛋白基因对2-十三烷酮以及阿维菌素耐受性的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 细胞自噬基因ATG8在棉铃虫中的表达 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 供试棉铃虫及饲养 |
| 5.2.2 实验试剂和仪器 |
| 5.2.3 Atg8基因的克隆 |
| 5.2.4 Atg8基因与进化树分析 |
| 5.2.5 关于Atg8的荧光定量PCR |
| 5.2.6 数据分析与统计 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 Atg8基因cDNA序列的克隆 |
| 5.3.2 棉铃虫Atg8进化树分析 |
| 5.3.3 棉铃虫Atg8在不同组织和不同发育阶段的表达规律 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 外源化合物诱导棉铃虫ATG8的表达 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 供试棉铃虫及饲养 |
| 6.2.2 实验试剂和仪器 |
| 6.2.3 生物测定 |
| 6.2.4 荧光定量PCR |
| 6.2.5 细胞自噬现象的电镜观察 |
| 6.2.6 RNAi棉铃虫Atg8基因 |
| 6.2.7 数据统计与分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 外源化合物诱导棉铃虫P-糖蛋白在组织中的表达 |
| 6.3.2 干扰棉铃虫Atg8基因对2-十三烷酮以及阿维菌素耐受性的影响 |
| 6.3.3 细胞自噬现象的电镜观察 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.1.1 P-糖蛋白的研究总结 |
| 7.1.2 Atg8的研究总结 |
| 7.1.3 P-糖蛋白与Atg8结果比对分析 |
| 7.2 本研究的创新点 |
| 7.3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）芹菜素逆转HCT116/L-OHP细胞耐药性及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肿瘤多药耐药 |
| 1.1.1 肿瘤多药耐药概述 |
| 1.1.2 肿瘤多药耐药机制 |
| 1.2 P-糖蛋白与耐药的关系 |
| 1.2.1 P-糖蛋白概述 |
| 1.2.2 影响P-糖蛋白表达的机制 |
| 1.3 bcl-2 蛋白与耐药的关系 |
| 1.3.1 bcl-2 基因 |
| 1.3.2 bcl-2 凋亡抑制作用 |
| 1.4 结肠癌耐药及相关机制 |
| 1.5 芹菜素概述 |
| 1.6 奥沙利铂概述 |
| 1.7 研究思路与研究问题 |
| 第2章 芹菜素逆转HCT116/L-OHP细胞耐药性及其机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验细胞株 |
| 2.2.2 实验药品及试剂 |
| 2.2.3 实验仪器及设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 药液与试剂的配制 |
| 2.3.2 细胞培养技术 |
| 2.3.2.1 细胞培养及传代 |
| 2.3.2.2 细胞冻存 |
| 2.3.2.3 细胞复苏 |
| 2.3.2.4 细胞换液 |
| 2.3.2.5 细胞计数 |
| 2.3.2.6 血清灭活 |
| 2.3.3 芹菜素对结肠癌细胞体外增殖的影响 |
| 2.3.4 芹菜素对结肠癌细胞耐药逆转作用 |
| 2.3.5 芹菜素对罗丹明123 在细胞内蓄积的影响 |
| 2.3.6 芹菜素对HCT116/L-OHP细胞凋亡的影响 |
| 2.3.7 Q-PCR检测芹菜素对P-gp、bcl-2的mRNA表达水平的影响 |
| 2.3.7.1 细胞接种 |
| 2.3.7.2 总RNA提取 |
| 2.3.7.3 RNA逆转录成cDNA |
| 2.3.7.4 SYBR Green I实时荧光定量PCR |
| 2.3.7.5 实时荧光定量PCR实验注意事项 |
| 2.3.8 芹菜素对P-gp、p-Akt、IκBα、p-IκBα、bcl-2、bax、caspase-3 表达水平的影响 |
| 2.3.8.1 细胞接种、给药 |
| 2.3.8.2 蛋白提取 |
| 2.3.8.3 总蛋白浓度测定(BCA试剂盒) |
| 2.3.8.4 Elisa法检测各个指标的蛋白浓度 |
| 2.4 统计学方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 芹菜素对结肠癌细胞体外增殖的影响 |
| 3.1.1 芹菜素给药24h对 HCT116和HCT116/L-OHP细胞的抑制作用 |
| 3.1.2 芹菜素给药36h对 HCT116和HCT116/L-OHP细胞的抑制作用 |
| 3.1.3 芹菜素给药48h对 HCT116和HCT116/L-OHP细胞的抑制作用 |
| 3.2 芹菜素对结肠癌细胞耐药逆转作用 |
| 3.2.1 芹菜素给药24h对结肠癌细胞耐药逆转作用 |
| 3.2.2 芹菜素给药36h对结肠癌细胞耐药逆转作用 |
| 3.2.3 芹菜素给药48h对结肠癌细胞耐药逆转作用 |
| 3.3 芹菜素对罗丹明123 在结肠癌细胞内蓄积的影响 |
| 3.4 芹菜素对HCT116/L-OHP细胞凋亡率的影响 |
| 3.5 芹菜素对P-gp基因、bcl-2 基因mRNA表达水平的影响 |
| 3.5.1 标准曲线 |
| 3.5.2 扩增曲线及溶解曲线 |
| 3.5.3 芹菜素给药对bcl-2 基因及P-gp基因mRNA表达水平的影响 |
| 3.6 芹菜素对P-gp、p-Akt、IκBα、p-IκBα、bcl-2、bax、caspase-3 蛋白表达水平的影响 |
| 3.6.1 BCA法测定总蛋白浓度 |
| 3.6.2 芹菜素对P-gp蛋白及NF-κB通路蛋白表达水平的影响 |
| 3.6.2.1 芹菜素对P-gp蛋白表达水平的影响 |
| 3.6.2.2 芹菜素对p-Akt蛋白表达水平的影响 |
| 3.6.2.3 芹菜素对IκBα蛋白表达水平的影响 |
| 3.6.2.4 芹菜素对p-IκBα蛋白表达水平的影响 |
| 3.6.3 芹菜素对bcl-2、bax、caspase-3 蛋白表达水平的影响 |
| 3.6.3.1 芹菜素对bcl-2 蛋白表达水平的影响 |
| 3.6.3.2 芹菜素对bax蛋白表达水平的影响 |
| 3.6.3.3 芹菜素对caspase-3 蛋白表达水平的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 MTT实验研究芹菜素对结肠癌HCT116/L-OHP耐药性的逆转作用 |
| 4.2 芹菜素对P-糖蛋白的功能、表达的影响及影响机制 |
| 4.2.1 芹菜素对P-糖蛋白的功能、表达的影响 |
| 4.2.2 芹菜素对P-糖蛋白作用机制 |
| 4.3 芹菜素对细胞凋亡的影响 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文与研究成果清单 |
| 致谢 |
（8）初步探讨P糖蛋白在黄连素调节胰岛素分泌机制中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、黄连素与胰岛素分泌相关性研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 黄连素干预下P糖蛋白及胰岛素分泌分泌相关蛋白的表达量变化 |
| 1.2.2 不同浓度黄连素干预后胰岛素分泌变化 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 黄连素与细胞凋亡及胰岛素分泌 |
| 1.3.2 黄连素与胰岛素合成 |
| 1.3.3 黄连素与P糖蛋白及胰岛素分泌 |
| 1.3.4 黄连素与钙离子通道 |
| 1.3.5 黄连素与Caveolin1及胰岛素分泌 |
| 1.4 小结 |
| 二、P糖蛋白表达与胰岛素分泌相关性研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 荧光显微镜观察832/13β细胞转染效率 |
| 2.2.2 832/13细胞P糖蛋白siRNA静默后mRNA表达结果 |
| 2.2.3 832/13细胞P糖蛋白RNAiP糖蛋白及相关蛋白表达结果 |
| 2.2.4 832/13β细胞P糖蛋白RNAi后胰岛素分泌变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 P糖蛋白 |
| 2.3.2 P糖蛋白与钙离子通道 |
| 2.3.3 P糖蛋白与Caveolin1及胰岛素分泌 |
| 2.3.4 P糖蛋白与凋亡、胰岛素合成及胰岛素分泌 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 F-actin、小GTP酶、SNARE蛋白与胰岛素分泌的关系 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（9）大鼠胰岛beta细胞mini-P-糖蛋白及P糖蛋白表达的初步探究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、大鼠胰岛及INS-1细胞P糖蛋白mRNA的表达分析 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 P糖蛋白 |
| 1.3.2 P糖蛋白与胰岛素分泌 |
| 1.3.3 Northern blotting结果 |
| 1.4 小结 |
| 二、western blotting在蛋白表达水平探究mini-P-糖蛋白 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、黄连素、环孢菌素A及阿霉素对P糖蛋白相关基因表达的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 不同药物对P糖蛋白相关基因表达的影响 |
| 3.2.2 不同浓度的黄连素对P糖蛋白相关基因表达的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 qReal-time -PCR |
| 3.3.2 黄连素与胰岛素分泌 |
| 3.3.4 环孢菌素A与胰岛素分泌 |
| 3.3.5 阿霉素与胰岛素分泌 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（10）P-糖蛋白在神经细胞内的降解机制及其临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
四、P-糖蛋白的融合表达研究（论文参考文献）
- [1]绵羊捻转血矛线虫耐药性调查及耐IVM候选基因的筛选与分析[D]. 罗晓平. 内蒙古农业大学, 2021
- [2]P-糖蛋白潜在抑制剂高效筛选方法的建立及其体内外评价研究[D]. 曹雨虹. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [3]基于机器学习和集成方法预测化合物的血脑屏障渗透性的研究方法[D]. 刘黎黎. 辽宁大学, 2021(12)
- [4]知母多成分的体内外跨膜转运机制与脑部分布研究[D]. 周雯婷. 中国医药工业研究总院, 2020(06)
- [5]脂筏成分量化与吸附性能关系研究[D]. 陈昱初. 江苏大学, 2019(03)
- [6]外源化合物对棉铃虫P-gp和Atg8基因的诱导表达[D]. 向敏. 中国农业大学, 2017(08)
- [7]芹菜素逆转HCT116/L-OHP细胞耐药性及其机制研究[D]. 李晶晶. 北京理工大学, 2016(03)
- [8]初步探讨P糖蛋白在黄连素调节胰岛素分泌机制中的作用[D]. 乌洪芳. 天津医科大学, 2015(06)
- [9]大鼠胰岛beta细胞mini-P-糖蛋白及P糖蛋白表达的初步探究[D]. 申翔. 天津医科大学, 2014(01)
- [10]P-糖蛋白在神经细胞内的降解机制及其临床意义[D]. 王慧. 泰山医学院, 2014(03)