一、人细胞骨架调节蛋白基因NELIN cDNA的克隆及特征分析(英文)(论文文献综述)
秦曼[1](2021)在《一个高度近视家系PRSS56突变鉴定及该基因与屈光不正相关性研究》文中研究表明[目 的]屈光不正的定义为眼在不使用调节时,平行光线通过眼的屈光介质后,不能在视网膜上清晰成像,而在视网膜前或后方成像。它包括远视、近视及散光。屈光不正患病率迅速上升,对公众健康有着极大的影响。其中,高度近视常伴有其他严重并发症,三分之一的高度近视患者会出现不可逆的视力障碍或失明。屈光不正的遗传方式多样,遗传学研究有利于屈光不正的基因诊疗。本研究的主要目的在于拟对一个高度近视家系进行致病基因筛查,明确导致其高度近视的致病基因,并试图探索其突变致病的分子机制。[方 法](1)收集一高度近视家系,经屈光检查、眼前段及眼底疾病的排外检查,诊断为遗传性高度近视,并绘制家系图。获得每一位受试者的知情同意后,收集患者及家属的临床资料和外周血并提取DNA;选取一核心家系的三位成员DNA进行全外显子组测序,筛选致病基因并进行Sanger验证和共分离分析;(2)结合既往文献报道,整理PRSS56既往突变位点,筛选一个导致近视(c.G88A(A30T))、一个导致远视(c.G926C(W309S))的突变位点,以及本高度近视家系筛选出的突变位点(c.C827T(A276V)),作为进行下一步功能验证对象;(3)对该基因结构域、突变位点的进化保守性、稳定性进行分析;使用Pymol软件对突变蛋白进行同源建模,分析突变位点对蛋白质结构的影响;(4)合成PRSS56全长,构建C端带有FLAG的PRSS56野生型载体,在野生型载体模板上进行定点突变,将野生型和突变型载体瞬时转染到HEK-293T细胞内;(5)将细胞分为5组,WT组:野生型组;c.C827T(A276V)组:本研究鉴定的高度近视突变组;c.G88A(A30T)组:另一近视组;c.G926C(W309S)组:高度远视组;NC组:仅加入转染试剂的空白对照组;(6)转染48h后收集细胞培养上清,用ELISA测定上清中PRSS56浓度,测定不同分组活性;(7)除NC外四组细胞进行Western印迹法检测FLAG和Calnexin的表达并进行比较;(8)除NC外各分组进行Flag与Calnexin免疫双荧光检测,用共聚焦显微镜观察各组间的细胞形态学变化,并进行比较;(9)各分组细胞提取RNA后进行转录组测序分析;(10)实验数据用GraphPad Prism 6软件进行分析,用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行比较,p<0.05被认为数值差异显着,具有统计学意义,所有实验均独立重复3次。[结 果](1)纳入本研究的高度近视家系共有四代27名成员,其中有10名患者被诊断为高度近视(9名女性,1名男性),所有家庭成员均未患有与高度近视无关的严重眼部疾病和全身疾病;(2)筛选出三个候选基因:PRSS56、COL18A1、HNF1A,验证发现PRSS56,c.C827T(A276V)与本研究家系7个高度近视患者实现家系基因共分离;(3)通过生信分析,可知PRSS56 c.C827T(A276V)这一突变刚好发生于PRSS56蛋白质的保守结构域,各物种该位点均呈现高度保守性,且该突变会破坏野生型蛋白结构稳定性,使蛋白质3D构象产生显着改变;(4)转染48小时后的各组细胞培养上清中PRSS56浓度:c.G88A(A30T),c.C827T(A276V)和 c.G926C(W309S)显着增加(P<0.01);结果还显示,c.G926C(W309S)与NC组相比显着减少(P<0.01),而WT组与c.G88A(A30T)相比显着减少(P<0.05);(5)各分组 PRSS56 活性:c.G88A(A30T),c.C827T(A276V)活性变化轨迹大致相同,均在1h后逐渐下降;c.G926C(W309S)组活性值逐渐下降,1h达到最低后基本维持相同水平,并且活性水平与近视分组相比较低;(6)由Western-blot结果可知,Flag标记的PRSS56这一融合蛋白仅在膜级份结构上表达;c.G88A(A30T),c.C827T(A276V)PRSS56融合蛋白高表达,分别与c.G926C(W309S)组,WT组相比具有显着差异(P<0.05);(7)细胞转染48h后各分组免疫荧光染色细胞在共聚焦显微镜下无差异,Flag与Calnexin均定位于内质网;(8)转录组分析结果如下:差异基因数量:c.G926C vs c.G88A&c.C827T 为 1321 个,WT vs c.G926C 为 157 个,WT vs c.C827T为80个,WT vs c.G88A差异基因数量为49个,可见c.G926C vs c.G88A&c.C827T明显高于其余三组;WT vs c.C827T和WT vs c.G88A共有的基因中,上调的有3个,下调的有6个,其中ANKHD1与PRSS56有较强关联;各组聚焦到的调控通路如下:c.G926C vs c.G88A&c.C827T:微管细胞骨架组织;WT vs c.C827T:对钙离子的反应、前体代谢产物和能量的产生;WT vs c.G88A:细胞防御反应、翻译后蛋白质修饰;WT vs c.G926C:氧化磷酸化、线粒体组织。[结 论](1)本研究招募的四代常染色体显性高度近视家系,他们表现出疾病的临床表型,如屈光度≤-6.0D,眼轴长度>26mm,部分家庭成员已伴发高度近视并发症,如白内障、视网膜脱落、豹纹样眼底改变等;本研究首次在一中国高度近视家系中鉴定出PRSS56基因新的错义突变:c.C827T(A276V);该突变位点与高度近视具有极强关联性,与家系患者实现共分离;该突变是高度保守的氨基酸取代,且通过改变残基之间的连接方式引起蛋白质构象变化导致其结构不稳定;(2)细胞功能机制研究验证了 PRSS56是一种分泌蛋白,定位于内质网,且突变后不改变其亚细胞定位;导致近视的突变型转染细胞分泌的丝氨酸蛋白酶浓度比高度远视组和野生型高,符合PRSS56功能丧失导致眼球缩小,与近视相关的PRSS56突变可能以相反的方式起作用这一初步预测,从而为PRSS56调控眼轴增长提供新的见解;(3)转录组测序分析结果提示PRSS56突变导致高度近视的调控通路与微管细胞骨架组织等具有较强的关联,且可能与ANKHD1基因有相关性,有待我们下一步的验证。
缪立英[2](2019)在《LINC00612在膀胱癌中的生物学功能及机制研究》文中指出膀胱癌(bladder cancer,BC)是一种泌尿系统常见的恶性肿瘤,其发病率和病死率居高不下,严重威胁人体健康。近年来,随着科学技术的发展,我们对BC的认识愈加深入,对其致病机制及发生发展有了更深的理解,在治疗方面也取得了较大的进展,但是BC的预后仍不理想,尤其是晚期患者,无法显着改善其生存情况,因此,深入研究BC发生和发展的分子机制,筛选特异性标志物具有十分重要的理论意义和临床价值。长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是非编码RNA,长度超过200个核苷酸,可影响调节基因的表达。LncRNA缺乏完整的开放阅读框,没有蛋白编码功能。哺乳动物基因组序列中多达4-9%的序列可以产生LncRNA。LncRNA最初被认为是基因组转录的“暗物质”或“噪音”,没有生物学功能。后来的研究表明,LncRNA参与了许多重要的细胞功能,如X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活或抑制等,可以促进相关信号通路的分子功能改变,改变细胞的生命活动。上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是上皮来源的恶性细胞由于迁移和侵袭能力增强,向间充质细胞转化的生物学过程。EMT的特征性改变包括上皮细胞极性的丧失、细胞间连接的降解、细胞骨架结构重组引起的细胞形态学改变、上皮基因表达下调伴间充质基因表达上调。这些变化使细胞具有更强的迁移、侵袭和降解细胞外基质的能力。竞争性内源性 RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)是 LncRNA 的一种重要的调控机制。LncRNA通过吸收多种微小RNA(microRNA,miRNA),调节靶基因的表达水平。目前LncRNA在BC中已有一些研究,但作为ceRNA在BC的发生发展以及与上皮-间充质转化相关的转移侵袭中的作用仍不明确,有待进一步研究。本研究分为三个部分,第一部分通过LncRNA芯片筛选BC和癌旁组织中差异性表达的LncRNA,检测其在BC组织和细胞中的表达水平,并通过体外实验和体内实验明确其在BC中的生物学功能;第二部分通过体外实验及体内实验明确LINC00612/miR-590/PHF-14构成ceRNA网络对BC发生发展的调控作用;第三部分通过体外实验阐明LINC00612/miR-590/PHF-14轴对BC细胞上皮-间充质转化的影响。第一部分 LINC00612对膀胱癌细胞增殖和侵袭能力的影响[目的]明确BC组织与癌旁组织中LncRNA的表达谱,筛选表达差异最显着的LncRNA,并研究其在BC中的生物学功能。[方法]通过LncRNA微阵列分析,分析13个BC组织与8个癌旁非肿瘤组织中LncRNA的表达差异,选取表达差异最显着的LncRNA,并在BC组织及BC细胞株中应用实时定量反转录酶-聚合酶链锁反应(quantitative reverse transcript-ion-polymerase chain reaction,qRT-PCR)及原位杂交(In Situ Hybridization,ISH)实验进行验证。核质分离实验及荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)确定其亚细胞定位。CCK8、集落形成及Transwell实验明确体外LINC00612对BC细胞增殖、侵袭能力的影响。裸鼠成瘤实验及生物荧光体外成像技术验证体内LINC00612对BC细胞增殖、侵袭能力的影响。[结果]选择前60个在BC组织与癌旁组织中差异表达显着的LncRNA(Fold Change>1.5,P<0.01),其中LINC00612差异表达最显着。BC组织中LINC00612的表达水平明显高于癌旁组织,BC细胞中LINC00612的表达水平明显高于膀胱上皮永生细胞。LINC00612主要定位于细胞质中。体外实验显示:在BC细胞中过表达LINC00612,BC细胞增殖及侵袭能力增强;下调LINC00612,BC细胞增殖及侵袭能力下降。上述结果在体内实验中得到了证实。[结论]LINC00612在BC组织和细胞中表达异常上调,并且在BC中作为促癌基因发挥增强细胞增殖与侵袭能力的作用。第二部分 LINC00612/miR-590/PHF-14构成ceRNA网络调控膀胱癌发生发展的研究[目的]鉴定LINC00612调控的下游miRNA及靶基因,阐明LINC00612构成ceRNA网络调控BC发生发展的机制。[方法]通过生物信息学方法筛选LINC00612可能结合的miRNA,RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)、RNA pull down及双荧光素酶报告基因实验验证LINC00612与目标miRNA的结合关系。调节BC细胞中LINC00612的表达,观察目标miRNA水平的变化。应用生物信息学方法筛选目标miRNA可能调控的下游靶基因,qRT-PCR、RIP和双荧光素酶报告实验验证目标miRNA与靶基因的结合关系。调节BC细胞中目标miRNA的表达,qRT-PCR和western blotting检测靶基因在mRNA和蛋白水平的表达。细胞功能回复实验(挽救实验)和体内实验验证上述结果。[结果]生物信息学方法筛选miR-590是LINC00612下游的目标miRNA,RIP、RNA pull down和双荧光素酶报告实验证明,LINC00612和miR-590可以直接结合。BC细胞中调节LINC00612的表达,miR-590的表达变化呈负性相关。生物信息学方法筛选miR-590下游靶基因,经qRT-PCR、RIP和双荧光素酶报告实验验证,PHF-14是miR-590下游的靶基因。BC细胞中调节miR-590的表达,PHF-14的表达变化呈负性相关。细胞功能回复实验显示LINC00612/miR-590/PHF-14轴可调控BC细胞的增殖及侵袭,该结果在体内实验中也获得了进一步证实。[结论]LINC00612通过海绵样吸附miR-590进一步调控下游靶基因PHF-14的表达,并由此影响BC细胞的增殖及侵袭能力,LINC00612/miR-590/PHF-14构成ceRNA网络调控BC的发生发展。第三部分 LINC00612/miR-590/PHF-14轴调控膀胱癌细胞上皮-间充质转化的研究[目的]研究LINC00612/miR-590/PHF-14轴对BC细胞上皮-间充质转化的调控作用。[方法]通过western blotting及FISH实验检测LINC00612/miR-590/PHF-14轴对E-cadherin、N-cadherin和vimentin表达水平的影响。[结果]LINC00612 下调增强了 E-cadherin 的表达,削弱了 N-cadherin 和 vimentin 的表达,LINC00612过表达抑制了E-cadherin的表达,而N-cadherin和vimentin表达增加,PHF14可以取消LINC00612对E-cadherin和vimentin表达的调控作用。[结论]LINC00612/miR-590/PHF-14轴通过ceRNA机制调控BC细胞上皮-间充质转化。
吴海滨[3](2019)在《多肽微阵列技术监测胶质瘤患者血清MGMT自身抗体的临床价值》文中进行了进一步梳理目的:在肿瘤患者血清中发现的肿瘤特异性自身抗体已被认为是肿瘤早期诊断,预测复发风险和评估治疗反应的潜在的标志物。本研究旨在探讨血清O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)自身抗体作为胶质瘤诊断、预测复发风险及评估耐药的新型生物标志物的临床应用价值,并预测MGMT蛋白的B细胞线性表位。方法:1.对MGMT蛋白进行叠瓦式切割,构建MGMT多肽库,建立稳定的MGMT多肽微阵列检测方案。2.血清样本收集:本研究共纳入180例不同WHO病理级别的胶质瘤患者和311例健康志愿者血清样本。分别在3个时间点采集患者血清样本:术前、术后30天、胶质瘤复发时。3.采用多肽微阵列技术,检测术前胶质瘤患者和健康对照组患者血清中MGMT自身抗体的响应情况。4.以各条多肽在胶质瘤组与健康对照组中阳性反应率差异最大的SNR值为截断值,找出在胶质瘤组中高响应的多肽,并用高响应的MGMT自身抗体评估其作为诊断胶质瘤的效能。5.然后利用不同时间点采集的胶质瘤患者血清样本,研究MGMT自身抗体的变化规律。6.采用单因素和多因素分析方法,分析术前胶质瘤患者血清中MGMT自身抗体状态和水平与胶质瘤预测复发风险和耐药的相关性。7.利用生物信息学手段预测的B细胞表位系列与胶质瘤中高响应的多肽系列进行比对,预测高响应MGMT多肽自身抗体识别的B细胞线性表位位点,探讨其潜在的临床应用前景。结果:1.在胶质瘤患者血清中能够检测到MGMT多肽自身抗体,并鉴定出5条在胶质瘤组中高响应的MGMT多肽自身抗体(MGMT-02,MGMT-04,MGMT-07,MGMT-10,MGMT-18)。2.受试者工作曲线(ROC)分析表明,与单个MGMT多肽自身抗体诊断相比,5条多肽自身抗体的联合应用在胶质瘤与健康对照的鉴别中是最有效的,该联合诊断模型将曲线下面积增加到0.81(95%置信区间为0.69-0.87),总体敏感性为75%,特异性为83%;在高级别胶质瘤组中更明显,曲线下面积为0.84(95%置信区间为0.78-0.90),总体敏感性为75%,特异性为89%。3.术后第30天MGMT自身抗体水平下降,当肿瘤复发时,MGMT自身抗体水平升高并达到术前水平。4.单因素和多因素分析显示,仅仅术前血清MGMT-02多肽自身抗体状态和水平与无复发生存独立相关(p<0.05),与胶质瘤WHO级别,年龄,性别,Ki-67表达无关(p>0.05)。术前血清阳性(SNR值5.5-20)患者较血清阴性患者复发时间短,与联合替莫唑胺放化疗耐药相关,血清MGMT-02多肽自身阳性(SNR值≥20)患者除外。术前监测MGMT-02肽自身抗体水平,对胶质瘤患者的识别、预测高危复发患者及替莫唑胺放化疗耐药有重要意义。5.将预测的B细胞表位序列与5条多肽的氨基酸序列进行比较,每条多肽有12个以上连续氨基酸序列相同。结论:在本回顾性研究中,我们提供了在胶质瘤血清中MGMT多肽自身抗体存在的证据,并在胶质瘤组中鉴定出5条高响应多肽。我们的研究表明,MGMT自身抗体可用于胶质瘤的诊断,预测复发风险和评估化疗耐药。我们确定的5条在胶质瘤病人高响应多肽,可能对开发新的单克隆抗体和针对MGMT不同表位的多肽癌疫苗有用。
田凯[4](2018)在《鸡胸肌组织发育过程中差异基因的筛选及功能验证》文中认为鸡肉在我国肉类消费结构中占有重要地位,产肉性状一直是鸡遗传育种研究领域的热点。我国地方鸡种具有独特的基因资源,如何从功能性转录组和调控性转录组层面来解析肌肉生长发育的分子调控机制,将成为鸡遗传改良工作的重要突破口。对不同生长发育时期肌肉组织转录水平上的分析,有助于了解该组织生长发育相关基因和调控因子之间所参与的分子调控机制。本试验利用RNA-seq技术对不同发育时间点胸肌组织的mRNAs和lncRNAs进行了系统地筛选和分析,筛选与肌肉生长发育相关的lncRNAs和mRNAs并构建两者的分子调控网络,初步探讨lncRNAs与mRNAs在调控肌肉发育方面的关系;另外,在筛选到的差异基因中,本试验选择GPR133和SH3BP5基因在细胞水平上进行功能验证,首先通过克隆技术得到与肌肉生长发育相关基因GPR133的两个转录亚型,并在细胞水平上验证了GPR133的两个转录亚型以及差异基因SH3BP5的功能。主要研究结果如下:(1)在49个测序文库中总共获得了817.74 Gb原始数据(Raw data),其中约有706.32 Gb的高质量读段(Clean data)达到质控标准被保留下来,最终产生的高质量读段有74%~88.8%的Reads能比对到鸡基因组上。通过对Clean Reads的比对和组装,共鉴定出17905个编码蛋白mRNAs和28032个定位到基因组位置的lncRNAs,其中包括9594个基因区的lncRNAs和15946个基因间区的lncRNAs。与lncRNAs相比,mRNAs转录本具有长度更长、所含外显子数目更多、表达水平更高的特征,而在染色体分布方面,大部分的mRNAs和lncRNAs都分布在鸡大型染色体上,具有明显的倾向性。根据mRNAs表达量层次聚类、主成份分析以及mRNAs和lncRNAs表达量的相关性分析发现各样本生物学重复间的相关性较高。(2)在胚胎发育中期、胚胎发育后期、生长发育旺盛期及成年期中分别有1020、294、165和299个高表达的基因;随着生长发育的进行,大部分差异表达的mRNAs和lncRNAs总体呈现下调趋势;在300天肌肉组织中筛选到263和131个特异表达的mRNAs和lncRNAs;通过进一步的筛选,得到82和34个与肌肉生长发育强相关的mRNAs和lncRNAs。通过对这些肌肉特异性表达或与生长发育强相关mRNAs的功能预测发现,许多编码蛋白的基因显着富集到转录调控以及与肌肉生长发育和代谢相关的生物学过程和信号通路中,表明这些基因可能参与肌肉生长发育和代谢过程。(3)通过构建肌肉特异性mRNAs和lncRNAs的共表达调控网络,总共得到了5个共表达网络图和网络图中一些核心的mRNAs和lncRNAs,其中一些lncRNAs与一个或多个mRNAs有直接的交互作用。例如lncRNAs TU124209与MYOG,TU60015与SRBD1和MYOC(肌纤蛋白)都有直接的交互作用。(4)利用RACE-PCR结合RT-PCR的方法克隆得到了鸡GPR133基因两个大小分别为3385和3289 bp的转录亚型GPR133-va和GPR133-vb,其中GPR133-va保留了所有的26个外显子,而GPR133-vb则通过外显子4跳跃的可变剪切方式产生。两个亚型的预测蛋白结构都含有3段保守结构域,分别是N端的Lam G和GPS,以及C端的G蛋白偶联受体家族典型的七次跨膜结构域7TM。对GPR133基因两个转录亚型在鸡31个器官组织中的表达谱分析发现,两个亚型在多个器官组织中都有较高表达。(5)分别将GPR133基因不同转录亚型的特异性干扰si RNA片段转染至鸡卫星细胞中发现,干扰GPR133基因两个转录亚型后,卫星细胞增殖数都变少,相关增殖和分化标记基因的表达量也显着下调,表明GPR133基因的两个转录亚型可以促进鸡卫星细胞的增殖和分化。(6)在鸡卫星细胞中过表达SH3BP5基因后,细胞增殖数目减少,细胞增殖标记基因CCNB2表达量下调,P21基因表达量上调;另外,过表达SH3BP5基因后抑制了相关成肌分化标记基因的表达,结果说明SH3BP5基因可以抑制鸡卫星细胞的增殖和分化。本研究从转录组层面初步解析家鸡肌肉各个生长发育阶段的分子差异,构建了lncRNAs与mRNAs的分子调控网络,并对差异基因GPR133的不同转录亚型以及SH3BP5的功能进行了初步验证,丰富了家禽胚胎期以及胚后期转录遗传信息,为我国地方鸡种的先天选育提供遗传资源和分子理论基础。
李兴霞[5](2017)在《长牡蛎左右外套膜的分子差异研究》文中研究指明长牡蛎(英文名:Pacific oyster,拉丁文名:Crassostrea gigas)又称为太平洋牡蛎,属于软体动物门、双壳纲、牡蛎目、牡蛎科、牡蛎属。牡蛎肉鲜味美,营养价值极高,可以加工成单冻半壳牡蛎、牡蛎提取液、牡蛎保健品、蚝油等,是一类十分重要的海洋食品。长牡蛎最大的特点是左壳可以很牢固的附着到其它物体表面,而右壳却不能。我们推断左壳中应该具有一些右壳中不存在的特殊物质来执行附着功能。牡蛎的壳是由外套膜生物矿化形成的,左外套膜形成左壳,右外套膜形成右壳。左右壳功能的不同也就意味着左右外套膜分子的差异。我们从左右外套膜分子差异入手,试找出左壳的附着机制,为以后进一步分析研究执行附着机制的特殊物质,提供理论基础。而且牡蛎生活的早期有个浮游的过程,幼虫随海流寻找适合固着的场所,这种附着是在水下完成的,也就意味着特殊粘性物质在水中也可以发挥作用。为以后提高牡蛎壳的附加值提供一条途径,同时,本研究的结果还为左右对称动物的对称器官功能分化研究提供一些线索,也为如何提高牡蛎幼虫的附着率提供了重要参考。目前,关于左、右外套之间功能差异的分子机制尚不清晰。本研究分析比较了长牡蛎左右外套膜间的差异蛋白、差异表达基因、甲基化差异基因,通过取交集,筛选出了与长牡蛎附着有关的基因,通过分析,认为长牡蛎左壳附着可能与TGF-β信号通路有密切关系;通过研究两种钾离子通道抑制剂:TEA(电压门控钾离子通道抑制剂)和格列本脲(内向整流性钾离子通道抑制剂)对牡蛎幼虫附着的影响,发现电压门控钾离子通道在长牡蛎幼虫附着中可能起着更重要的作用;另外,我们克隆了在长牡蛎左右外套膜中表达量有差异的钙调素蛋白基因(cgCaM),分析了其组织表达特征、进化特征和功能意义。具体结果如下:1.完成了对长牡蛎附着斑蛋白、左右壳蛋白的提取与测定,并分析了左右壳的蛋白差异表达情况。分别分离并提取左、右壳的总蛋白质(包括可溶性和不可溶性基质蛋白)。根据已完成的长牡蛎的壳蛋白组,通过比较分析确定了左右壳以及附着斑的蛋白组。通过与已知的248个牡蛎蛋白比对,在左右壳内,分别找到26个及22个蛋白质。比较分析左、右壳间的蛋白表达情况,共发现3个差异表达蛋白。由于是利用已发现的牡蛎壳蛋白的数据寻找的左、右壳差异表达蛋白,因此,仅在248个蛋白内,进行肽段的比对,在左、右壳的蛋白数据中共发现6个共同变化蛋白质。相比于右壳,在长牡蛎的左壳中有3个蛋白(EGF,Hsp70,SOD)出现了差异变化。2.通过RNA-seq技术比较分析了长牡蛎左右外套膜的mRNA表达情况,共有18457个基因具有GO注释信息,左右外套膜组织内基因多集中在细胞内过程,代谢过程,生物调节,应激反应等生物学过程中。通过对左右外套膜基因FPKM值的比较,分析差异表达基因分布情况,显示长牡蛎左右外套膜中表达的相关胞外蛋白存在一定的差异,左右外套膜在指导相关分子的跨膜转运、细胞粘附及转录过程中存在一定的差异,从而可能是导致两侧壳的外形及功能出现差异的原因之一。分析差异表达的基因,其中,在左外套膜中有5个过氧化酶较右外套膜中的表达量出现了显着下调。在左外套膜中的低表达POD(过氧化物酶)可能说明在非特异性免疫防御的氧化应激方面,长牡蛎的右壳要起到更大的作用。KCP及Temptin在左右外套膜中的差异表达,也许说明其可能是调控长牡蛎左壳及右壳具有不同外形及功能的关键分子。3.通过MethylRAD技术比较分析了长牡蛎左右外套膜的基因组DNA甲基化差异,在CCGG位点共找到2286个差异基因,在CCWGG位点共找到2522个差异基因。相关基因的甲基化差异可能表明长牡蛎左右外套膜中神经信号传递,转录,RNA及蛋白质的调节等方面存在显着的差异,其中TGF-β信号通路关键基因(PITX2和BMP4)的甲基化水平存在明显差异,说明牡蛎的左右外套膜可能存在发育的差异,并导致两侧的功能及功能差异产生。整合RNA-seq及甲基化分析结果,发现多种TGF-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路相关基因的差异表达,可能说明虽然长牡蛎是双贝类,但是在长期的自然选择下,左右外套膜发生了左右不对称发育,并进化出了不同的功能,特别是左壳能够附着的功能。通过荧光定量分析,相比于右外套膜,在长牡蛎左外套膜中CMP和COL的上调表达可能说明在左右外套膜间的差异结构组建。而PITX2和KCP在左外套膜中的下调表达暗示长牡蛎中的左右不对称发育调节差异,可能是导致长牡蛎左壳与右壳具有不同外形及功能的原因。4.在长牡蛎左右外套膜转录组的差异基因集中发现了两种钾离子通道蛋白,为了确定哪种钾离子通道对于牡蛎附着变态具有更重要的意义。我们完成了钾离子浓度对长牡蛎附着与变态作用率的影响研究,通过不同的钾离子暴露试验,显示牡蛎幼虫的相对变态率会随着钾离子浓度的增加而降低。利用两种钾离子通道抑制剂TEA(电压门控钾离子通道抑制剂)和格列本脲(内向整流性钾离子通道抑制剂)研究钾离子通道对牡蛎幼虫附着的影响,我们发现TEA对幼虫的附着的抑制作用更明显,表明电压门控钾离子通道在长牡蛎幼虫附着中可能起着更重要的作用。5.在长牡蛎左右外套膜转录组的差异基因中集中发现了钙调控蛋白基因,了解长牡蛎钙调蛋白基因的序列和功能特征,将帮助我们理解软体动物壳形成的分子机制。为了获得长牡蛎钙调蛋白的具体信息,我们克隆了长牡蛎钙调蛋白基因(cgCaM)的全长cDNA序列,发现其ORF编码113个氨基酸,含有3个EF-hand钙结合结构域,其mRNA表达水平在外套膜中最高,这表明cgCaM基因可能在长牡蛎的壳形成过程中起重要作用,进化分析表明腹足纲和双壳纲的共同祖先可能拥有至少3个CaM基因。我们还发现,钙化程度高的物种中含有更多的EF-hand钙结合结构域,而在参加比较的几种软体动物中,长牡蛎具有最厚重的贝壳,长牡蛎基因组中也含有最多数量的EF-hand钙结合结构域,这进一步提示了 CaM和生物矿化之间的联系。
郑旭晨[6](2016)在《乙型脑炎病毒强弱毒毒力差异的分子机制研究》文中研究表明乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是黄病毒科黄病毒属成员,通过侵害中枢神经系统引发人和猪、马、野生水禽等动物的病毒性脑炎,危害严重。因JEV具有神经毒力,对减毒活疫苗的安全性担忧使其仍不能被广泛接受。寻找JEV基因组中的毒力位点并探索其减毒机制是进一步研究JEV致病机理、研制安全有效的新型疫苗的关键。本研究以具有强神经毒力的JEV HEN0701株及其细胞传代致弱株HEN-10S3为研究对象,利用反向遗传操作技术,探索导致JEV毒力差异的分子基础及毒力增强或减弱的分子机制。JEV反向遗传操作系统的建立因其cDNA克隆在宿主菌中所具有的“遗传不稳定性”而受到阻碍。为了建立稳定的JEV全长感染性cDNA克隆,我们以HEN0701株基因组中极易发生突变的5’端序列区段(nt 1-2913)为研究对象,利用软件寻找影响病毒cDNA稳定性的相关序列,验证该序列对病毒cDNA克隆稳定性的影响,并对其进行定点突变和原核启动子活性的测定。结果发现,JEV基因组nt 54-120较高的原核启动子活性和JEV结构基因在宿主菌中的表达共同导致了JEV cDNA克隆在E.coli中难以稳定增殖。于基因组nt 1275与nt 1600之间截断E基因可以稳定cDNA克隆。于nt 90做A-C突变虽可降低原核启动子活性,但不能稳定克隆。室温(25°C)培养转化菌,nt 54-120的原核启动子活性有效降低,明显提高了2913-nt cDNA克隆在宿主菌中的遗传稳定性。因此,低温培养转化菌是提高黄病毒cDNA克隆在宿主菌中遗传稳定性的有效方法。以低温培养转化菌为基本前提,我们将HEN-10S3基因组全长分为相互重叠的四段,并在第一段5’端加上NotI酶切位点和T7启动子序列,在第四段3’末端加上HDV核酶序列和XhoI酶切位点。利用四条片段重叠序列以及pBR322M载体序列中合适的酶切位点,将四条片段于pBR322M中依次拼接成全长cDNA,构建HEN-10S3全长cDNA克隆pBAHC。经过体外转录并转染BHK-21细胞,获得拯救病毒vAHEN。经鉴定,拯救病毒与亲本毒在体外生长特性和对小鼠神经毒力两方面都具有相似特性。克隆pBAHC具有较好的稳定性且易于操作,连同本实验早期构建的HEN0701感染性克隆pJEHEN,为进一步深入研究JEV毒力差异提供了关键的技术平台。以HEN0701和HEN-10S3全长感染性cDNA克隆为基础,将两病毒5’-UTR和结构蛋白编码区序列(5’UTR-C-PrM-E)互换。分别构建了以HEN0701基因组为骨架嵌合克隆JE-H/5’-CPrME(S)和以HEN-10S3基因组为骨架的嵌合克隆JE-S/5’-CPrME(H),并拯救出嵌合病毒vJE-H/5’-CPr ME(S)和vJE-S/5’-CPrME(H)。对3w小鼠的毒力测试结果显示,与亲本毒相比,嵌合病毒神经毒力发生显着变化。vJE-S/5’CPr ME(H)毒力明显上升,表现出强毒特性;而vJE-H/5’CPrME(S)毒力显着下降,表现出弱毒特性。说明所替换序列对病毒毒力存在重要影响。由于在该序列中仅存在E蛋白第138位氨基酸(E-138 Glu/Arg)一个位点的差异,说明E-138位点可能是影响病毒神经毒力的关键位点。利用PCR定点突变技术,将HEN0701 E-138 Glu(E)分别突变为酸性氨基酸Asp(D),碱性氨基酸Arg(R)和Lys(K)及中性氨基酸Phe(F)、Ala(A)和Gln(Q)。将HEN-10S3 E-138 R突变成E-138E。并拯救突变病毒vHE138D、vHE138R、vHE138K、vHE138F、vHE138A、vHE138Q和vSE138E。突变病毒对3w小鼠的毒力测试结果显示,vHE138D和vSE138E具有强神经毒力;vHE138R和vHE138K无神经毒力;vHE138F、vHE138A和vHE138Q具有一定的神经毒力,介于之间。说明E-138确实是影响JEV神经毒力的关键位点,且毒力的强弱与该位点的酸碱性质有关。利用生物信息学软件分析HEN0701 E蛋白结构,发现E蛋白E-138与E-47位氨基酸在空间结构上相邻,以氢键相连,但连接方式随毒力不同而不同。为了研究E-47对病毒毒力的影响及其与E-138之间的关系,将HEN0701 E-47位Asn(N)分别突变为酸性氨基酸Asp(D)、碱性氨基酸Lys(K)和中性氨基酸Ala(A),拯救出突变病毒vHE47D、vHE47K和vHE47A。其对小鼠的毒力测试结果显示,vHE47D具有强神经毒力;vHE47K无神经毒力;vHE47A神经毒力介于之间。说明JEV E蛋白第47位氨基酸是能够影响病毒神经毒力的潜在毒力位点,且病毒毒力与该位点氨基酸的酸碱性质有关。根据本研究中所构建的14种重组病毒毒力差异与两位突变位点酸碱性质之间的关系,发现E-47与E-138位氨基酸的酸碱性质共同决定了病毒的神经毒力,酸性越强则毒力越强,当两个位点同时为酸性氨基酸时,病毒毒力最强。综上所述,本研究通过一系列试验发现在低温培养转化菌可以有效提高黄病毒cDNA克隆在宿主菌中的遗传稳定性,并在此基础上,成功构建了JEV弱毒株HEN-10S3全长cDNA感染性克隆,并拯救出与亲本毒特性相似的重组病毒。以此感染性克隆及强毒株HEN0701感染性克隆为工具,通过强、弱毒株间的嵌合和定点突变,首次发现影响JEV毒力的关键位点除E-138外,还有E-47,且两位点氨基酸的酸碱性质共同决定了JEV神经毒力。由于E-138与E-47空间位置相邻,推测其所在结构可能是影响病毒毒力的关键结构。
陈媛[7](2016)在《番鸭就巢性状转录组、IncRNA的鉴定与分析》文中进行了进一步梳理本研究利用RNA-seq技术对就巢期和产蛋期的番鸭卵巢进行转录组测序,并结合生物学信息技术对各测序文库中的mRNA和lncRNA进行鉴定和分析,主要结果如下:1.通过观察番鸭卵巢组织切片,发现产蛋期卵巢中的原始卵泡均匀地分布在皮质浅层,皮质内部初级卵泡和次级卵泡数量丰富,成熟卵泡突出卵巢表面;而就巢期卵巢中的原始卵泡密集地、不规则地分布在皮质浅层,皮质内部有多个不同发育阶段的闭锁卵泡。2.6个RNA测序文库共获得约62M(million)的Raw Reads,共产生89.43Gb(gigabases)的数据,其中97.14%的Raw Reads作为高质量的Clean Reads被保留下来,各样品Q20碱基百分比大于或等于96.87%。与参考基因组比对,样本的平均比对率约为51.18%。3.番鸭卵巢转录组测序分析共获得334个差异表达基因。以产蛋组为对照组,就巢组有58个上调表达基因和包括IGF-I、PGR和PLCβ等在内的276个下调表达基因。GO注释发现,这些差异表达的基因与多细胞生物进程、结构发育、细胞物质交换和离子交换等有关。KEGG注释富集到80条KEGG通路中,可能参与调控番鸭就巢的信号通路包括:卵母细胞减数分裂(oocyte meiosis)、GnRH信号通路等。4.产蛋组平均筛选到11150条lncRNA转录本,就巢组平均筛选到1 1619条转录本。番鸭卵巢lncRNA的外显子个数平均为2.5个,开放阅读框(ORF)的平均长度为70.08nt,转录本平均长度为502.13nt。5.番鸭卵巢lncRNA测序分析共获得36个差异表达的lncRNA。以产蛋组为对照组,就巢组有25个下调表达基因和11个上调表达基因。差异表达的lncRNA靶基因KEGG富集结果显示,cis作用调控的靶基因主要富集到Wnt通路(Wnt signal pathway)和卵母细胞减数分裂等相关通路;trans作用调控的靶基因主要富集到粘着斑(Focal adhesion)和细胞骨架调节(Regulation of actin cytoskeleton)等与细胞增殖相关通路。差异表达的lncRNA的靶基因与番鸭多种生理过程相关,提示这些差异表达的lncRNA可能参与番鸭的就巢过程。此外,我们发现2个差异表达的lncRNA:TCONS 01271971和TCONS01559410,分别靶定到已知与就巢相关的VIP和FSHβ基因上,并且TCONS01559410只在就巢期表达。
王海波[8](2015)在《基于RNA-Seq解析小桐子抗冷性形成的分子机制及其关键基因的克隆与功能分析》文中研究表明为缓解不断增加的能源需求与有限化石燃料储备以及环境恶化之间的矛盾,寻找更加生态、可持续再生的替代能源已成为未来新能源的发展方向。利用能源植物生产生物柴油与生物酒精类燃料是目前研究的热点。其中,小桐子作为一种新兴的能源植物,因其种子含油量高可制备生物柴油、不与粮食作物争地及改良生态环境等方面的特性而备受关注。由于起源热带,冷害成为限制小桐子产量及种植面积进一步扩大的主要因素。因此,深入研究小桐子的抗冷性形成机制并利用基因工程手段对其进行改良,培育耐冷新品种,是目前亟待解决的种质问题。本研究中,我们通过Illumina Hiseq 2000高通量测序技术对小桐子低温锻炼条件下的转录组(Transcriptome)进行了测序,共获得了55,112,142条clean reads片段,包含4,960,092,780nt。经过从头拼接,共得到106,749条序列重叠群(Contig),平均长度为338bp;进一步组装得到45,251条Unigene序列,平均长度为789bp。通过Blast序列比对与ESTscan软件预测,发现有34,274条Unigenes(75.74%)包含完整或部分的蛋白质编码区(33,362条通过Blast比对得到,912条通过ESTscan软件预测得到)。有35,791条Unigenes注释到了如Nr、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG等不同蛋白质数据库。其中,27,293条Unigenes注释到GO数据库中的61个功能组中;11,887条Unigenes注释到了COG数据库中25个功能蛋白家族中;18,787条Unigenes注释到了KEGG数据库中的128条主要的代谢途径中。另外,45,251条Unigenes中共鉴定到6665个SSR位点,分布于5922条Unigenes中,平均长度12bp,平均发生频率为13.09%,SSR种类主要以单、二及三核苷酸重复为主,共占94.49%。基于转录组测序数据,我们对小桐子12℃低温锻炼12h、24h、48h的叶片材料进行了数字基因表达谱(Digital Gene Expression Profiling,DGE)的测序分析。与对照相比,小桐子经过12℃低温锻炼共发现4185个差异表达基因,在锻炼12h、24h、48h分别有1915、2085、3213个基因表达表现出差异性,在三个锻炼时间点都表现出差异表达的基因有553个。进一步分析表明,经过12℃低温锻炼12h、24h、48h,分别有1211、1302、2516个基因表达上调,同时分别有704、783、697个基因表达下调。上调表达的基因主要涉及电子传递与氧化还原平衡、水解酶与小分子运输蛋白家族、DNA或RNA结合蛋白类、各类转录因子如AP2/ERF与ABC等。对于主要代谢途径分析表明,小桐子在低温锻炼条件下,淀粉的分解代谢加剧,积累的渗透调节可溶性糖可能主要以肌醇、肌醇半乳糖苷以及蔗糖为主。而不依赖aba的cbf冷信号转导途径中,低温锻炼条件下各层次信号转导膜蛋白、激酶、cbf及其它多种转录因子都上调表达,说明cbf信号系统在小桐子抗冷性形成中起着重要作用。同时,小桐子在低温锻炼12h、24h、48h下,新诱导表达基因分别为238、160、330个,其中在不同锻炼时间点都诱导表达的新基因有61个,主要编码转移酶家族、dna结合蛋白家族、受体蛋白家族及氧化还原酶家族等。结合小桐子抗冷相关转录组与数字基因表达谱的测序数据分析结果,本工作还揭示了22个小桐子抗冷相关基因在小桐子抗冷性形成过程中的表达信息,同时也揭示了它们的组织表达特异性。22个基因在根中基本上都有基础表达,但随着低温锻炼时间的延长,其表达量总体表现为先下调后上调的表达模式,一般在12℃低温锻炼24h时达到最大表达量,其中以nsltpa、ga20ox、admt、dxs、pip2、dhn2、lea5表现最为显着。在茎中,所筛选的22个基因有18个对低温锻炼应答不明显,与对照一样都表现为本底表达;gsts、apx1、lea5表达则表现出低温诱导性;而pdi基因表达量甚微。在叶中,22个基因表达差异性最大,大部分基因表现为随低温锻炼时间的延长逐渐上调表达,而且在12℃低温锻炼24h时达到最大表达量。另外,部分低温锻炼新表达基因在对照条件下没有本底表达,这也与数字基因表达谱分析结果一致,如dnaj、chs、lrr-rlk、admt、dxs、apx1等基因。为进一步理解小桐子抗冷性形成机制,我们从小桐子中克隆了低温锻炼下差异表达变化较大的gs3、nsltpa基因,低温新诱导表达的chs、ga20ox基因,抗氧化和维持大分子功能相关的pdi与msra基因,以及cbf基因家族的两个成员cbf1与cbf2基因。氨基酸序列分析表明,gs3包含由7个平行β-折叠及8个氨基酸残基组成的保守活性中心,而nsltpa包含由4对二硫键(由8个cys残基形成)维系的4段α-螺旋构成的基序结构,都属于多基因家族,且分化上存在跳跃现象。chs属于pks家族,存在典型的查耳酮合酶及对苯乙烯合酶活性位点、产物结合位点与丙二酰-coa结合位点;而ga20ox属于2-odd家族,存在双层β-桶结构及h-d-h基序;两者在进化上都较为保守,与其它植物的直系同源蛋白都存在至少70%以上的序列相似性。pdi属于硫氧还蛋白家族,而我们克隆的小桐子pdi蛋白属于典型的l型成员,具有-a-b-b′-a′-结构域排列方式与两个-cghc-催化核心,并具备-kdel-内质网驻留信号,锚定在内质网膜上,发挥二硫键氧化、还原及异构化的功能。msra属于msr家族a亚家族,与该家族中的msrb、frmsr在氨基酸一级序列、高级结构等方面没有同源性,具有a亚家族蛋白的典型-gcgwp-保守序列以及3个α-螺旋包裹的6个β-折叠片层组成的α/β卷状结构;克隆的CBF1基因氨基酸序列中存在一个典型AP2基序,负责结合COR基因的CRT/DRE顺式作用元件,但没有鉴定到保守的Val-Glu-Glu残基,而是仅发现了中间部位的Glu。对其启动子序列分析发现,CBF1基因启动子区域包含典型的TATA框、CAAT框,以及ICE结合元件、MYB结合元件、MYC结合元件,表明CBF1受多种激素等信号的诱导,并参与多种逆境胁迫的应答。同时,重组GS3、nsLTPA、CHS及PDI酵母在低温下的长势都明显好于对照酵母菌,暗示这些基因与小桐子抗冷性直接相关,对于小桐子抗冷性的基因工程改良具有较大应用潜力。总之,我们在本研究中通过高通量测序技术得到了小桐子低温锻炼条件下的转录组数据,通过数字基因表达谱分析揭示了小桐子抗冷相关基因的表达模式及参与的主要代谢途径,并且实验鉴定了22个抗冷相关基因在根、茎及叶中的表达模式。另外,基于以上结果综合筛选,克隆了8个关键基因的全长cDNA,并对其进行了生物信息学分析及功能鉴定。从意义上而言,本研究初步阐明了小桐子低温锻炼下抗冷性形成的分子机制,得到的Unigenes序列极大地丰富了目前NCBI中小桐子的核酸数据库,为后续抗冷相关基因的克隆并通过基因工程手段对小桐子进行改良提供了理论与实践基础。
何青[9](2015)在《PRRSV不同致病性毒株非结构蛋白诱导靶细胞细胞因子差异表达的分子基础》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus, PRRSV)引起的高度接触性传染病,主要引起妊娠母猪严重的繁殖障碍以及仔猪的呼吸道疾病,已经成为对世界养猪业造成重大经济损失的疫病之一。2006年我国出现并流行以非结构蛋白2(Nsp2)编码区30个不连续氨基酸缺失为分子特征的高致病性PRRSV,造成以高热、高发病率和高死亡率为特征的严重型PRRS,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。目前为止,高致病性PRRSV毒株的致病性增强的分子机制尚不完全清楚。猪肺泡巨噬细胞(Pulmonary alveolar macrophages, PAMs)是PRRSV惑染的主要靶细胞,PRRSV感染对靶细胞造成的损伤和功能的改变是其致病的一个重要原因。本研究从PRRSV影响PAMs功能的角度入手,着重研究不同致病性PRRSV毒株对PAMs细胞因子表达的影响,并分析导致不同毒株诱导PAMs表达TNF-α差异的病毒蛋白,为阐明高致病性PRRSV致病性增强的分子机制奠定基础。首先分析了不同致病性PRRSV毒株对PAMs细胞因子表达的影响。分别用PRRSV高致病性毒株(JXwn06)和低致病性毒株(HB-1/3.9)感染PAMs,从mRNA专录和蛋白水平分析它们对PAMs细胞因子表达的影响。用荧光定量PCR检测感染AMs中白细胞介素(IL)-1β、IL-8、IL-10、干扰素(IFN)-α, IFN-β和肿瘤坏死因子(TNF)-α的mRNA转录水平,并用ELISA检测细胞培养上清中的细胞因子。结果显示,促炎细胞因子IL-1β和IL-8无论是在mRNA还是蛋白质水平,两个毒株感染组之间均无统计学差异:两个毒株感染PAMs后都可下调上清中Ⅰ型干扰素的水平,无显着差异;同时,与低致病性毒株相比,高致病性毒株能诱导产生更高水平的IL-10,并抑制TNF-α的表达。提示:高致病性PRRSV感染在诱导宿主免疫抑制和拮抗宿主的抗病毒效应中具有重要作用。从不同致病性PRRSV毒株诱导TNF-α的差异表达角度入手,分析了引起PAMs TNF-α差异表达的病毒蛋白。同时,进一步运用反向遗传技术构建病毒蛋白编码区互换的嵌合病毒,证实了在诱导HMF-α差异表达中起关键作用的病毒蛋白。荧光素酶报告试验结果表明,Nsp7、Nsp11和Nsp12是不同致病性PRRSV毒株诱导TNF-α的mRNA差异表达的病毒蛋白。通过分析各个非结构蛋白对ERK信号通路的影响,结果发现高致病性PRRSV毒株的Nsp1β和Nsp11能抑制ERK信号通路,进而抑制TNF-a蛋白产生。运用反向遗传技术同时置换Nsp1β和Nsp11的PRRSV拯救毒能反转TNF-a蛋白差异表达的现象,证实Nsp1β和Nsp11在不同致病性PRRSV毒株诱导的TNF-α差异表达中发挥重要作用。研究结果表明,高致病性PRRSV通过其Nsp1β和Nsp11可有效抑制TNF-α产生,从而有利于其在宿主体内的复制,这可能是导致其致病性和毒力增强的机制之一。综上所述,我们的研究揭示了不同致病性PRRSV毒株对PAMs细胞因子表达的差异影响,并鉴定出Nsp1β和Nsp11是决定高、低致病性毒株诱导TNF-α差异表达的病毒蛋白。研究结果为阐明高致病性PRRSV毒株致病性增强的分子机制提供了科学依据。
曾丽霞[10](2014)在《去泛素化酶Ataxin-3在胃癌中的表达及作用地位的研究》文中提出研究背景胃癌(Gastric cancer,GC)是最常见、死亡率最高的恶性肿瘤之一。我国是胃癌的高发地区,每年因胃癌死亡人数占到所有因癌症死亡人数的23.2%。进展期胃癌患者的预后较差、术后的5年生存率不超过30%。对进展期胃癌的多靶点的联合用药治疗成为人类抗击胃癌的重要新策略。由于恶性肿瘤发病的分子机制复杂而多样,目前关于胃癌发病的分子机制依然不是很清楚,所以有效的治疗靶点的认定仍面临巨大挑战,大量的研究仍有待进一步进行。泛素蛋白酶体系统(UPS)是机体内主要的蛋白质降解和质控的方式之一。它通过对变性、错误折叠、异常聚集及翻译后损坏蛋白的降解发挥重要的细胞定量控制作用。在某些情况下,异常蛋白超过了UPS的降解能力,导致泛素化异常蛋白的积聚,最终可导致细胞的功能障碍、死亡及包括恶性肿瘤在内的重大疾病的发生。去泛素化酶DUB是UPS中重要的一环,其可识别泛素、底物蛋白或蛋白酶体的特异序列,发挥特异性的去泛素化作用。涉及调控恶性肿瘤细胞功能的主要表现在以下几个方面:1)细胞信号通路的调控。2)与细胞的生存及细胞周期相关的调控。3)参与转录的调控。泛素化与去泛素化的改变与多种肿瘤的发生密切相关。Ataxin-3作为一种去泛素化酶,与目前发现的与肿瘤发生发展有关DUBs功能上存在许多相似之处,故其在恶性肿瘤发生、发展中的作用值得进一步研究。Ataxin-3是一个多聚谷氨酰胺蛋白(polyglutamine, polyQ),是一种重要的去泛素化酶(Deubiquitinating enzyme,DUB)。最初被认为是脊髓小脑型共济失调/马查多-约瑟夫病III型(spinocerebellar ataxin type3andMachado-Joseph disease, SCA3/MJD)发病的核心病因。Ataxin-3蛋白由ATXN3(MJD)基因编码,广泛表达于全身各组织;ATXN3基因位于人的14q21。目前报道的人Ataxin-3蛋白有12种转录亚型,其中最长的亚型约有376个氨基酸残基,分子量约为42kDa。Ataxin-3蛋白包含了一个球状的、有去泛素化功能的N-末端Josephin domain(JD)结构域;其C-末端尾部具有23个可与泛素结合的基本模式UIM(ubiquitin-interacting motifs)结构和多聚谷氨酰胺蛋白polyQ区域。其主要功能包括以下1)可与泛素、多聚泛素链、泛素样蛋白(如Nedd8)及泛素化蛋白作用。2)具有DUB活性,有编辑多聚泛素链的功能。3)可与蛋白酶体的亚基作用。4)与VCP/p97等复合分子相互作用。涉及的主要细胞和生化的过程包括:去泛素化活性影响蛋白质的降解、转录的调控、细胞的凋亡及死亡通路的调控、某些组织细胞的分化发育及细胞骨架的形成等方面。作为一种去泛素化酶,其存在许多和目前研究发现的与恶性肿瘤发生、发展密切相关的DUBs相似之处。目前有关Ataxin-3的研究是很有限的;在细胞的恶性转化及肿瘤的发生发展中的地位和作用鲜见报道。新近应用DUBs的siRNA筛选技术,在非小细胞肺癌中研究发现Ataxin-3是调控PTEN信号通路效果最强的DUBs之一;在ANTX3基因功能缺陷的情况下,A549细胞中PTEN的转录增强,足够下调Akt的磷酸化及PI3K通路的活化,使细胞的生存活性下降。p53基因是至今为止发现的与人类多种肿瘤相关性最高的基因之一,正常和突变的Ataxin-3皆有使p53转录活性增强的作用。CHIP(Hsc70羧基端结合蛋白,C-terminal heat shock protein70-interacting protein),又名STUB1或STIP1是一种重要的分子伴侣依赖的泛素连接酶E3,参与扩展突变Ataxin-3和p53蛋白的UPP降解;而Ataxin-3可通过限制泛素化链的长度,参与CHIP泛素化循环的始末并发挥调控作用。而胃癌组织中是否有差异性表达的Ataxin-3?Ataxin-3是否参与胃癌细胞的生长和凋亡失调控的过程?类似于与Ataxin-3相互作用的CHIP及p53的网络关系是否存在于胃癌中?皆未见研究报道。目前尚未见有确切的研究资料表明Ataxin-3在胃癌中的表达及作用。本研究拟探讨Ataxin-3在胃癌中的表达,并对其相关功能和机制行初步探索。本研究内容包括以下三部分:第一部分Ataxin-3在胃癌中的表达及意义目的:检测Ataxin-3蛋白在胃癌组织、癌旁对应上皮内瘤变组织及对照胃黏膜组织中的表达,分析与胃癌患者的临床病理学资料的关系,并进行单因素和多因素分析;检测Ataxin-3的mRNA在胃癌组织及对照黏膜组织中的表达,分析胃癌组织中,Ataxin-3是否在转录水平上存在差异性表达;检测人胃黏膜上皮细胞(GES-1)、来源于中分化胃癌细胞(SGC7901)及来源于低分化胃癌细胞(MKN45)的Ataxin-3蛋白和mRNA的表达,进一步分析Ataxin-3在胃癌中的差异表达。探讨Ataxin-3在胃癌发生、发展过程中的意义,通过本研究的实施为确立Ataxin-3在胃癌中的作用及地位提供一定的实验依据。方法:1.应用免疫组织化学方法检测Ataxin-3蛋白在胃癌组织(536例)、癌旁对应上皮内瘤变组织(低级别86例、高级别75例)及对照胃黏膜组织(312例)中的表达,并结合胃癌患者的临床病理学特征,分析其与胃癌上皮内瘤变的关系,与胃癌的临床病理学特征之间的相关性,并进行单因素和多因素分析。2.应用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)的方法检测Ataxin-3的mRNA在胃癌组织(14例)及对照胃黏膜组织(14例)中的表达,分析胃癌组织中,Ataxin-3是否在转录水平上存在差异性表达。3.应用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和蛋白的免疫印迹(Western blot,WB)检测人胃黏膜上皮细胞(GES-1)、来源于中分化胃癌细胞(SGC7901)及来源于低分化胃癌细胞(MKN45)中Ataxin-3的mRNA和蛋白的表达,进一步分析Ataxin-3在胃癌中的差异表达。结果:1.免疫组化检测结果显示,所有312例对照胃黏膜组织中Ataxin-3蛋白100%表达;低级别上皮内瘤变(86例)、高级别上皮内瘤变(75例)和胃癌(536例)三组中Ataxin-3的阳性率分别为58.1%、88%和72.76%。各组的表达强度比较,胃癌组与高级别上皮内瘤变组比较无差异(P>0.05),其余各组间两两相比均有显着性差异(P<0.001)。2. Ataxin-3的蛋白表达与肿瘤的大小,Lauren的组织学分型,组织学分化及突变p53蛋白的表达有关(P<0.05),等级相关系数分别为:-0.087(P<0.05)、-0.384(P<0.000)、-0.230(P<0.000)及+0.108(P<0.05)。而与年龄,性别,肿瘤的部位,Bormann分型,浸润深度,淋巴结转移,远处转移及TNM临床分期无关(P>0.05)。3.536例患者中位生存期32.73个月,术后1、3、5年累积生存率为71%、46%、33%。4.单因素分析结果显示:肿瘤的部位、大小、Lauren组织学分型、浸润的深度、区域淋巴结转移的数目、肿瘤的远处转移、TNM分期及突变p53蛋白表达与5年生存率有关(P<0.05)。而年龄、大体类型、性别、组织学分化、癌栓、Ataxin-3蛋白表达、吸烟及饮酒史暂未发现与预后有关(P>0.05)。5.多因素分析表明肿瘤的部位,Lauren的组织学分型,组织学分化,TNM的临床分期和突变p53蛋白的表达是独立的胃癌的预后因素(P<0.05);未提示年龄,性别,肿瘤的大小,Bormann分型,吸烟和饮酒是有独立的预后意义(P>0.05)。6.荧光定量PCR检测GC的Ataxin-3mRNA表达,结果提示Ataxin-3mRNA在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达均低于对照的胃黏膜组织及细胞株(P<0.05);MKN45表达最低。7.WBt检测人GC细胞和对照胃黏膜上皮细胞,结果提示Ataxin-3蛋白在GES-1中表达最高,其余依次为SGC7901,MKN45表达最少。结论:1. Ataxin-3表达下调与胃癌特别是弥漫型胃癌发生和肿瘤细胞低分化状态等关系密切,提示其很可能是在胃癌发生、发展过程中有重要意义的分子。2.未能发现Ataxin-3与胃癌患者的预后有直接的相关性,推测它可能是起协同作用。Ataxin-3有望成为胃癌多靶点治疗的候选因子。第二部分Ataxin-3在胃癌细胞中的功能学研究目的: pLV-EF1a-EGFP-2A载体质粒转染SGC7901细胞,检测Ataxin-3过表达对SGC7901细胞的生长和凋亡,对p53、p21、Bax的mRNA表达,及对CHIP蛋白表达的影响。进一步从细胞功能学角度认证Ataxin-3在胃癌中可能的作用机制。方法:采用LV-EF1a-EGFP-2A-ATXN3及空转载体,瞬时转染SGC7901细胞,设立空白对照组(SGC7901);ATXN3过表达组;空载质粒组。通过CCK8法检测细胞的增殖,流式细胞术检测细胞的凋亡;荧光定量PCR检测细胞生长周期及凋亡相关因子如,p53、p21、Bax等mRNA表达;WB检测CHIP的蛋白表达。结果:1. ATXN3过表达的SGC7901细胞出现明显的生长抑制。2.流式细胞仪检测显示,ATXN3过表达组凋亡率明显增加。3. ATXN3过表达组与空白对照组(SGC7901)、空载质粒组相比均有p53的mRNA表达较低,Bax的mRNA表达较高(P<0.05);而p21的mRNA表达无差异(P>0.05)。4. WB检测显示过表达组的Ataxin-3明显增高而其的CHIP蛋白表达下调。结论:过表达的Ataxin-3可通过抑制胃癌细胞的生长,促进细胞的凋亡及影响CHIP的表达等机制参与胃癌的发生、发展;为Ataxin-3成为胃癌治疗的候选靶点提供实验依据。第三部分ATXN3-EGFP/SGC7901细胞模型的构建目的:为了进一步探讨Ataxin-3在胃癌中的功能及作用机制,我们构建携带ATXN3基因的慢病毒真核过表达载体,利用慢病毒载体系统将ATXN3转染至SGC7901细胞,建立稳定过表达Ataxin-3的SGC7901细胞模型(即ATXN3-EGFP/SGC7901),为后续的生物学研究提供稳定转染细胞株的实验平台。方法:将ATXN3基因全长cDNA克隆至慢病毒过表达载体pLV-EF1a-EGFP-2A,构建可同时独立表达GFP蛋白和ATXN3蛋白的慢病毒载体;采用感受态细菌完成质粒的克隆性扩增及抽提利用,对质粒的目的基因测序鉴定;之后在293T细胞完成慢病毒颗粒包装,并转染SGC7901细胞,流式荧光分选出稳定转染的SGC7901细胞,用WB检测稳转株中的ATXN3基因的蛋白表达。结果:1.经测序验证插入质粒的目的基因(ATXN3)序列正确。2.质粒慢病毒系统由载体质粒pLV-EF1a-EGFP-2A、包膜质粒PL1, PL2及包装质粒pMD2.G组成,并在293T细胞中完成包装。3. LV载体转染SGC7901细胞,转染后的细胞内可以观察到绿色荧光(由GFP蛋白发出);流式荧光分选稳定转染的SGC7901细胞,荧光分选率高于50%,筛选出可稳定过表达Ataxin-3的pLV-ATXN3-EGFP/SGC7901胃癌细胞;经WB检测显示ATXN3-EGFP/SGC7901组的Ataxin-3蛋白高表达。结论:成功构建了体外Ataxin-3过表达载体,实现了稳定转染后胃癌细胞SGC7901中Ataxin-3蛋白的高表达。为我们深入研究Ataxin-3对胃癌细胞生物学特性的影响提供细胞模型。
二、人细胞骨架调节蛋白基因NELIN cDNA的克隆及特征分析(英文)(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人细胞骨架调节蛋白基因NELIN cDNA的克隆及特征分析(英文)(论文提纲范文)
(1)一个高度近视家系PRSS56突变鉴定及该基因与屈光不正相关性研究(论文提纲范文)
缩略词表 |
中文摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
实验的不足 |
参考文献 |
附录 |
综述 丝氨酸蛋白酶56突变导致屈光不正的相关研究进展 |
参考文献 |
攻读学位期间获得的学术成果 |
致谢 |
(2)LINC00612在膀胱癌中的生物学功能及机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
参考文献 |
第一部分 LINC00612对膀胱癌细胞增殖和侵袭能力的影响 |
引言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第二部分 LINC00612/miR-590/PHF14构成ceRNA网络调控膀胱癌发生发展的研究 |
引言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第三部分 LINC00612/miR-590/PHF 14轴调控膀胱癌细胞上皮-间充质转化的研究 |
引言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
展望 |
结论 |
综述 长链非编码RNA在膀胱癌中表达的研究进展 |
参考文献 |
附录 缩略词表 |
攻读博士期间发表的文章 |
已发表英文论文 |
致谢 |
(3)多肽微阵列技术监测胶质瘤患者血清MGMT自身抗体的临床价值(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
引言 |
参考文献 |
第一部分 MGMT自身抗体在胶质瘤患者血清中的响应情况 |
前言 |
对象与方法 |
结果 |
讨论 |
本章小结 |
参考文献 |
第二部分 MGMT自身抗体在评估胶质瘤诊断价值中的研究 |
前言 |
对象与方法 |
结果 |
讨论 |
本章小结 |
参考文献 |
第三部分 MGMT自身抗体变化规律与胶质瘤复发的关系 |
前言 |
对象与方法 |
结果 |
讨论 |
本章小结 |
参考文献 |
第四部分 MGMT自身抗体与胶质瘤预测复发风险和耐药的关系 |
前言 |
对象与方法 |
结果 |
讨论 |
本章小结 |
参考文献 |
第五部分 MGMT蛋白B细胞线性表位预测与应用前景 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
本章小结 |
参考文献 |
全文总结及讨论 |
参考文献 |
综述 非侵入性诊断方法在胶质母细胞瘤诊断和监测治疗效果中的研究进展 |
参考文献 |
英文缩写一览表 |
攻读学位期间公开发表的论文和所获荣誉 |
致谢 |
(4)鸡胸肌组织发育过程中差异基因的筛选及功能验证(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
高频词汇中英文对照表 |
第一章 文献综述 |
1.1 鸡骨骼肌生长发育 |
1.1.1 鸡骨骼肌生长发育的形态学变化 |
1.1.2 鸡骨骼肌发育不同时期的调控因子 |
1.2 鸡肌肉组织的转录组学研究概况 |
1.2.1 转录组及其研究方法 |
1.2.2 鸡肌肉组织mRNAs研究进展 |
1.2.3 lncRNAs对鸡肌肉生长发育的作用 |
1.3 G蛋白偶联受体GPR133 的研究进展 |
1.3.1 GPCRs的发现和分类 |
1.3.2 GPR133 的结构和表达特征 |
1.3.3 GPR133 的功能 |
1.4 SH3BP5 基因的研究进展 |
1.4.1 SH3BP5 概述 |
1.4.2 SH3BP5 基因功能的研究进展 |
1.5 本研究的选题背景、目的意义及主要内容 |
1.5.1 选题背景 |
1.5.2 目的意义 |
1.5.3 主要内容及技术路线 |
第二章 鸡肌肉组织mRNAs和 lncRNAs的鉴定及差异分析 |
2.1 试验材料 |
2.1.1 试验动物 |
2.1.2 主要仪器设备与试剂 |
2.2 试验方法 |
2.2.1 鸡胚胎性别鉴定 |
2.2.2 组织石蜡切片制备及HE染色 |
2.2.3 总RNA提取及质量检测 |
2.2.4 RNA-seq文库构建和测序 |
2.2.5 测序数据的统计与分析 |
2.2.6 mRNAs的鉴定与分析 |
2.2.7 lncRNAs的鉴定与分析 |
2.2.8 相关性分析 |
2.2.9 lncRNA-mRNA共表达调控网络分析 |
2.2.10 RT-q PCR验证 |
2.3 试验结果 |
2.3.1 组织石蜡切片HE染色结果 |
2.3.2 mRNAs的鉴定及分析 |
2.3.3 lncRNAs的鉴定及分析 |
2.3.4 mRNAs和 lncRNAs联合分析 |
2.3.5 RT-qPCR验证结果 |
2.4 分析与讨论 |
2.4.1 鸡转录组mRNAs与 lncRNAs表达量及基因组特征 |
2.4.2 鸡肌肉组织差异mRNAs的生物学功能 |
2.4.3 lncRNAs对 mRNAs的调控作用 |
2.5 小结 |
第三章 GPR133 基因的克隆及其可变剪切的功能验证 |
3.1 前言 |
3.2 试验材料 |
3.2.1 试验动物 |
3.2.2 试验细胞 |
3.2.3 主要仪器设备及试剂 |
3.2.4 所用PCR引物信息 |
3.3 试验方法 |
3.3.1 总RNA的提取 |
3.3.2 GPR133 的克隆 |
3.3.3 生物信息分析 |
3.3.4 定量表达谱分析 |
3.3.5 细胞转染 |
3.3.6 细胞增殖检测 |
3.3.7 荧光定量检测 |
3.4 试验结果 |
3.4.1 GPR133 基因的克隆与鉴定 |
3.4.2 GPR133 基因对鸡骨骼肌卫星细胞增殖的作用 |
3.4.3 GPR133 对鸡骨骼肌卫星细胞分化的作用 |
3.5 分析与讨论 |
3.5.1 GPR133 基因的生物信息学分析 |
3.5.2 GPR133 两个亚型存在组织特异性分布 |
3.5.3 GPR133 不同亚型对鸡卫星细胞增殖的影响 |
3.5.4 GPR133 不同亚型对鸡卫星细胞分化的影响 |
3.6 小结 |
第四章 SH3BP5 对卫星细胞增殖和分化的影响 |
4.1 前言 |
4.2 试验材料 |
4.2.1 试验细胞 |
4.2.2 主要试剂和仪器 |
4.2.3 试验用载体 |
4.2.4 所用引物信息 |
4.3 试验方法 |
4.3.1 过表达载体的构建 |
4.3.2 重组质粒的提取 |
4.3.3 细胞转染 |
4.3.4 细胞增殖检测 |
4.3.5 荧光定量qPCR检测 |
4.4 试验结果 |
4.4.1 鸡骨骼肌卫星细胞的形态学观察 |
4.4.2 SH3BP5 对鸡骨骼肌卫星细胞增殖的作用 |
4.4.3 SH3BP5 对骨骼肌卫星细胞分化的作用 |
4.5 分析与讨论 |
4.5.1 SH3BP5 对鸡卫星细胞增殖的影响 |
4.5.2 SH3BP5 对鸡卫星细胞分化的影响 |
4.6 小结 |
第五章 主要结论与创新点 |
5.1 主要结论 |
5.2 创新点 |
参考文献 |
致谢 |
附录 |
作者简历 |
(5)长牡蛎左右外套膜的分子差异研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
英文缩略词中英文全称 |
第1章 前言 |
1.1 长牡蛎的简介 |
1.2 外套膜的功能及研究现状 |
1.2.1 贝壳的生物矿化 |
1.2.2 免疫作用 |
1.2.3 色素 |
1.2.4 神经传导 |
1.3 转录组技术 |
1.3.1 转录组测序概述 |
1.3.2 转录组测序在海洋贝类中的应用进展 |
1.4 蛋白质组学 |
1.4.1 蛋白质组学概述 |
1.4.2 蛋白质组学在海洋贝类中的应用 |
1.5 DNA甲基化技术在海洋生物中的研究现状 |
1.6 左右不对称发育 |
1.7 牡蛎附着功能的影响因素 |
1.8 研究的目的及意义 |
1.9 研究内容 |
1.10 技术路线 |
第2章 长牡蛎左右外套膜的蛋白质组学分析 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 材料与处理 |
2.1.2 试验试剂 |
2.1.3 仪器设备 |
2.1.4 试验方法 |
2.2 结果与分析 |
2.2.1 附着斑、左右壳的蛋白质组学分析 |
2.2.2 左右外套膜的蛋白质组学分析 |
2.3 结论与讨论 |
第3章 长牡蛎左右外套膜的转录组测序及MethylRAD技术分析 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 材料与处理 |
3.1.2 试验试剂 |
3.1.3 仪器设备 |
3.1.4 试验方法 |
3.2 结果与分析 |
3.2.1 转录组学结果分析 |
3.2.2 DNA甲基化结果分析 |
3.2.3 定量荧光PCR结果分析 |
3.3 结论及讨论 |
第4章 钾离子通道在长牡蛎幼虫附着过程中的功能研究 |
4.1 材料与方法 |
4.1.1 试验材料 |
4.1.2 试验试剂 |
4.1.3 试验设备 |
4.1.4 试验方法 |
4.2 结果与分析 |
4.2.1 钾离子对长牡蛎附着变态的影响 |
4.2.2 钾离子对长牡蛎附着变态的影响 |
4.2.3 添加钾离子通道抑制剂对长牡蛎附着变态的影响 |
4.3 结论及讨论 |
第5章 长牡蛎钙调蛋白基因全长cDNA的克隆和表征 |
5.1 材料与方法 |
5.1.1 试验材料 |
5.1.2 试验试剂 |
5.1.3 设备与仪器 |
5.1.4 试验方法 |
5.2 结果与分析 |
5.2.1 cgCaM的分子特性 |
5.2.2 cgCaM基因在不同器官中的表达模式 |
5.2.3 cgCaM直系同源肽的系统发生树 |
5.2.4 多个物种的基因组中EF-hand家族成员的数量 |
5.3 结论与讨论 |
第6章 讨论、结论与创新点 |
6.1 讨论 |
6.2 结论 |
6.3 创新点 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
攻读学位期间发表的论文 |
(6)乙型脑炎病毒强弱毒毒力差异的分子机制研究(论文提纲范文)
摘要 Abstract 第一章 引言 |
1.1 乙型脑炎病毒概述 |
1.2 JEV基因组结构及编码蛋白功能 |
1.3 嵌合病毒的构建在乙型脑炎病毒毒力相关因子研究上的应用 |
1.4 有关乙型脑炎病毒毒力差异位点的研究进展 |
1.5 乙型脑炎病毒减毒机制研究现状 |
1.6 本研究目的与意义 第二章 JEV CDNA克隆在宿主菌中不稳定因子的研究 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 菌株、毒株、细胞、重组质粒 |
2.1.2 主要试剂 |
2.1.3 引物设计与合成 |
2.1.4 菌株与培养温度对cDNA稳定性的影响 |
2.1.5 寻找JEV基因组中可能具有原核启动子活性的序列区段 |
2.1.6 PCR产物和酶切后产物胶回收 |
2.1.7 质粒构建 |
2.1.8 RNA二级结构预测 |
2.1.9 定点突变 2913-nt cDNA |
2.1.10 cDNA克隆在大肠杆菌中稳定性分析 |
2.1.11 原核启动子活性分析 |
2.1.12 Western Blot |
2.1.13 统计学分析 |
2.2 结果 |
2.2.1 宿主菌株对JEV cDNA克隆稳定性的影响 |
2.2.2 培养温度影响JEV cDNA克隆稳定性 |
2.2.3 JEV cDNA突变的特征 |
2.2.4 E基因部分截断对JEV cDNA克隆稳定性的影响 |
2.2.5 病毒ORF中的起始密码子影响 2913-nt cDNA克隆的稳定性 |
2.2.6 将JEV 5’ 端截短的重组质粒在大肠杆菌中的稳定性 |
2.2.7 JEV序列nt 54-120具有原核启动子活性 |
2.2.8 在nt 90处的突变不能稳定JEV cDNA克隆 |
2.2.9 室温培养降低JEV基因组中原核启动子的启动子活性 |
2.3 讨论 第三章 JEV弱毒株HEN-10S3反向遗传操作平台的建立 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 病毒、细胞、质粒 |
3.1.2 主要试剂和仪器 |
3.1.3 分段克隆 |
3.1.4 pCR定点突变 |
3.1.5 全长拼接 |
3.1.6 重组病毒的拯救 |
3.1.7 RNA提取 |
3.1.8 反转录多聚酶链反应(RT-PCR)和PCR产物的酶切鉴定 |
3.1.9 间接免疫荧光 |
3.1.10 病毒生长曲线的绘制 |
3.1.11 空斑形成试验 |
3.1.12 小鼠毒力测试 |
3.2 结果 |
3.2.1 JEV全长cDNA克隆pBAHC的构建及病毒的拯救 |
3.2.2 被拯救病毒vAHEN的鉴定 |
3.2.3 被拯救病毒vAHEN的生长特性分析 |
3.2.4 被拯救病毒vAHEN毒力测试 |
3.3 讨论 第四章 JEV强、弱毒株嵌合病毒的构建及其毒力分析 |
4.1 材料与方法 |
4.1.1 病毒、细胞、质粒 |
4.1.2 主要试剂和仪器 |
4.1.3 核苷酸序列分析 |
4.1.4 嵌合克隆的构建 |
4.1.5 嵌合病毒的拯救 |
4.1.6 病毒RNA提取 |
4.1.7 反转录多聚酶链反应(RT-PCR) |
4.1.8 间接免疫荧光 |
4.1.9 多步生长曲线的绘制 |
4.1.10 空斑形成试验 |
4.1.11 小鼠毒力测试 |
4.2 结果 |
4.2.1 JEV HEN0701和HEN-10S3基因组序列差异分析 |
4.2.2 JEV强、弱毒株结构蛋白编码区相互替换的嵌合病毒的构建及拯救 |
4.2.3 嵌合病毒的生长特性分析 |
4.2.4 病毒结构蛋白编码区序列对病毒神经毒力具有重要影响 |
4.3 讨论 第五章 JEV E-138突变对病毒神经毒力的影响 |
5.1 材料与方法 |
5.1.1 病毒、细胞、质粒 |
5.1.2 主要试剂和仪器 |
5.1.3 突变PCR |
5.1.4 E-138突变病毒的构建和拯救 |
5.1.5 反转录多聚酶链反应(RT-PCR) |
5.1.6 间接免疫荧光(IFA) |
5.1.7 小鼠脑神经细胞制备和原代培养 |
5.1.8 生长曲线绘制 |
5.1.9 空斑形成试验 |
5.1.10 脑内神经毒力测试 |
5.1.11 组织、细胞总RNA提取 |
5.1.12 荧光定量PCR |
5.1.13 免疫组织化学(IHC) |
5.1.14 病毒吸附试验 |
5.1.15 HEN0701 E蛋白结构分析 |
5.2 结果 |
5.2.1 E-138突变病毒拯救与鉴定 |
5.2.2 E-138突变病毒体外生长特性分析 |
5.2.3 E-138位氨基酸酸碱性质影响病毒毒力 |
5.2.4 E-138R突变病毒体内生长特性分析 |
5.2.5 E-138R突变病毒在体内引发促炎和抗病毒细胞因子表达能力低 |
5.2.6 E-138位氨基酸突变影响病毒在细胞表面的吸附能力 |
5.2.7 E-138位氨基酸突变改变E蛋白结构 |
5.3 讨论 第六章 JEV E-47突变导致病毒毒力改变 |
6.1 材料与方法 |
6.1.1 病毒、细胞、质粒 |
6.1.2 主要试剂和仪器 |
6.1.3 E-47突变病毒的构建和拯救 |
6.1.4 病毒RNA提取 |
6.1.5 反转录多聚酶链反应(RT-PCR) |
6.1.6 间接免疫荧光 |
6.1.7 生长曲线绘制 |
6.1.8 毒力测试 |
6.2 结果 |
6.2.1 E-47突变病毒的拯救和被拯救病毒的鉴定 |
6.2.2 被拯救病毒生长曲线的绘制 |
6.2.3 E-47位氨基酸酸碱性质影响病毒对小鼠的神经毒力 |
6.2.4 E-138与E-47位氨基酸的酸碱性质共同决定了病毒对小鼠的神经毒力 |
6.3 讨论 第七章 全文总结 参考文献 致谢 作者简介 |
(7)番鸭就巢性状转录组、IncRNA的鉴定与分析(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一章 文献综述 |
1 家禽就巢性研究进展 |
1.1 就巢相关基因研究进展 |
1.2 就巢相关通路研究进展 |
2 lncRNA |
2.1 lncRNA概述 |
2.2 lncRNA的特征 |
2.3 lncRNA的作用机制 |
2.4 lncRNA与雌性动物生殖 |
3 研究的目的与意义 |
第二章 番鸭就巢性状转录组分析 |
1 材料 |
1.1 试验动物 |
1.2 主要试剂 |
1.3 主要仪器 |
2 试验方法 |
2.1 卵巢组织切片制作 |
2.2 卵巢组织的RNA提取及测序文库构建 |
2.3 数据生物学信息分析 |
3 结果与分析 |
3.1 卵巢组织切片观察 |
3.2 Total RNA质量检测 |
3.3 测序数据概述及质量评估 |
3.4 可变剪切分析 |
3.5 差异表达分析 |
3.6 差异表达的mRNA的RT-PCR验证 |
4 讨论 |
4.1 卵巢组织切片观察 |
4.2 就巢性mRNA转录组分析 |
第三章 番鸭就巢性状lncRNA分析 |
1. 材料 |
2. 试验方法 |
2.1 卵巢组织的RNA提取及转录本构建 |
2.2 生物学信息分析 |
3 结果与分析 |
3.1 lncRNA筛选结果 |
3.2 蛋白编码潜能分析 |
3.3 候选lncRNA描述性统计 |
3.4 lncRNA与mRNA比较 |
3.5 差异lncRNA统计 |
3.6 差异表达lncRNA靶基因富集分析 |
3.7 差异表达的lncRNA的RT-PCR验证 |
4 讨论 |
4.1 lncRNA鉴定结果的可靠性 |
4.2 lncRA的基因组特征 |
4.3 差异表达lncRNA分析 |
结论 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
(8)基于RNA-Seq解析小桐子抗冷性形成的分子机制及其关键基因的克隆与功能分析(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
第1章 研究背景 |
1.1 研究开发和利用能源植物是产业发展战略的需求 |
1.2 发展能源植物与生物柴油产业面临的问题 |
1.3 小桐子是具有巨大开发潜力的能源植物 |
1.4 小桐子产业化存在的问题 |
1.5 低温胁迫下植物生理、生化及分子调节 |
1.5.1 植物的冷害及其机理 |
1.5.2 冷害与植物的抗冷性 |
1.5.2.1 膜系统与植物的抗冷性 |
1.5.2.2 抗氧化系统与植物的抗冷性 |
1.5.2.3 细胞内容物与植物抗冷性 |
1.5.3 植物抗冷性的分子生物学 |
1.5.3.1 植物响应低温信号转导系统 |
1.5.3.2 miRNA差异表达与植物抗冷性 |
1.5.3.3 小桐子基因组及抗冷相关功能基因的研究 |
1.6 研究契机 |
1.7 研究内容 |
1.8 研究目标 |
1.9 研究特色与创新性 |
1.10 研究技术路线 |
第2章 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 小桐子 |
2.1.2 大肠杆菌 |
2.1.3 酵母菌 |
2.1.4 克隆载体与表达载体 |
2.2 培养基 |
2.3 抗生素 |
2.4 菌种保存 |
2.5 实验仪器与设备 |
2.6 试剂与耗材 |
2.6.1 生化与分子生物学试剂 |
2.6.2 常用试剂配制 |
2.7 实验方法 |
2.7.1 基因组DNA的提取与纯化(试剂盒) |
2.7.2 RNA的提取与纯化 |
2.7.2.1 两步裂解法(用于抗冷相关基因的半定量RT-PCR实验) |
2.7.2.2 试剂盒TransZol法(用于基因克隆实验) |
2.7.3 核酸的琼脂糖凝胶电泳 |
2.7.4 反转录或第一链cDNA的合成 |
2.7.5 PCR反应体系 |
2.7.5.1 Dream Taq DNA Plymerase反应体系及程序 |
2.7.5.2 TransTaq DNA Polymerase High Fidelity (HiFi) 反应体系及程序 |
2.7.5.3 TransStart Taq DNA Polymerase反应体系及程序 |
2.7.5.4 2×EasyTaq PCR SuperMix反应体系及程序 |
2.7.6 DNA琼脂糖凝胶纯化回收 |
2.7.7 PCR产物纯化回收 |
2.7.8 质粒DNA提取 |
2.7.9 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
2.7.10 酵母菌感受态细胞的制备 |
2.7.10.1 LiAc/TE法 |
2.7.10.2 LiAc法 |
2.7.11 克隆与大肠杆菌的转化 |
2.7.11.1 TA克隆(基因克隆) |
2.7.11.2 DNA的酶切反应(双酶切) |
2.7.11.3 DNA的连接反应(酵母表达载体的构建) |
2.7.12 酵母菌的转化与阳性验证 |
2.7.12.1 LiAc/TE法 |
2.7.12.2 LiAc法(Gietz法) |
2.8 分子量标准 |
2.9 主要的分析软件 |
第3章 低温锻炼提高小桐子抗冷性过程中转录组的解析 |
3.1 研究的内容与目标 |
3.2 实验材料与方法 |
3.2.1 实验材料 |
3.2.2 实验方法 |
3.2.2.1 RNA-Seq测序文库的构建 |
3.2.2.2 测序reads去噪及序列从头(de nevo)拼接 |
3.2.2.3 Unigene数据的功能注释、分类及代谢途径分析 |
3.2.2.4 高表达Unigene数据的功能鉴定 |
3.2.2.5 抗冷相关代谢途径关键基因的表达分析 |
3.2.2.6 简单重复序列(SSR)标记位点分析 |
3.3 结果与分析 |
3.3.1 测序数据处理及统计 |
3.3.2 序列注释及蛋白编码框的识别 |
3.3.3 功能基因注释与分类 |
3.3.4 高表达量Unigenes的功能基因注释分析 |
3.3.5 转录组中抗冷相关Unigene表达分析 |
3.3.6 基于转录组的SSR分子标记分析 |
3.4 讨论 |
3.5 测序数据处理与提交NCBI |
第4章 低温锻炼提高小桐子抗冷性过程中数字基因表达谱的解析 |
4.1 研究目标与内容 |
4.2 实验材料与方法 |
4.2.1 实验材料 |
4.2.2 实验方法 |
4.2.2.1 数字基因表达谱测序样品的制备及测序 |
4.2.2.2 基于转录组测序数据的数字基因表达谱Tag的功能注释 |
4.2.2.3 差异表达基因的GO功能聚类及分析 |
4.2.2.4 小桐子抗冷相关功能基因的差异表达分析与鉴定 |
4.3 结果与分析 |
4.3.1 数字基因表达谱Tag处理与统计 |
4.3.2 小桐子低温锻炼条件下差异表达基因的鉴定 |
4.3.3 小桐子低温锻炼条件下差异表达基因的GO功能聚类分析 |
4.3.4 小桐子抗冷相关代谢或信号转导途径差异表达基因的鉴定 |
4.3.4.1 基于淀粉降解代谢的可溶性糖积累途径差异表达基因的鉴定 |
4.3.4.2 非ABA依赖的冷信号转导途径差异表达基因的鉴定 |
4.3.5 小桐子低温锻炼条件下新表达基因的鉴定 |
4.4 讨论 |
第5章 低温锻炼中小桐子关键功能基因的时空表达分析 |
5.1 研究的目标与内容 |
5.2 实验材料与方法 |
5.2.1 实验材料 |
5.2.2 实验方法 |
5.2.2.1 总RNA的提取、纯化和定量检测 |
5.2.2.2 cDNA第一链的合成 |
5.2.2.3 引物设计 |
5.2.2.4 引物测试 |
5.2.2.5 RT-PCR检测 |
5.2.2.6 基因表达模式的聚类分析 |
5.3 结果与分析 |
5.3.1 总RNA的提取及质量分析 |
5.3.2 小桐子抗冷相关基因在不同器官中的表达特性 |
5.3.3 冷锻炼条件下抗冷相关基因的RT-PCR分析 |
5.3.4 抗冷相关基因的表达模式聚类分析 |
5.4 讨论 |
第6章 GS3与nsLTPA基因的克隆及酵母功能验证 |
6.1 研究的内容与目标 |
6.2 材料与方法 |
6.2.1 实验材料 |
6.2.2 实验方法 |
6.2.2.1 RNA的提取、纯化及定量检测 |
6.2.2.2 cDNA第一链的合成 |
6.2.2.3 Jc GS3与JcnsLTPA基因全长cDNA的克隆 |
6.2.2.4 酵母表达载体的构建、转化 |
6.2.2.5 重组酵母菌抗冷性功能验证 |
6.3 结果与分析 |
6.3.1 JcGS3与JcnsLTPA基因全长cDNA的克隆 |
6.3.2 GS3与nsLTPA的生物信息学分析 |
6.3.2.1 Jc GS3与JcnsLTPA基因信息及结构 |
6.3.2.2 JcGS3与JcnsLTPA氨基酸序列功能元件鉴定 |
6.3.2.3 JcGS3与JcnsLTPA的进化分析 |
6.3.2.4 JcGS3与JcnsLTPA高级结构鉴定及分析 |
6.3.3 酵母表达载体构建与转化及抗冷性评价 |
6.3.3.1 酵母表达载体构建及转化 |
6.3.3.2 转基因酵母的抗冷性评价 |
6.4 讨论 |
6.4.1 JcGS3基因 |
6.4.2 JcnsLTPA基因 |
第7章 CHS与GA20ox基因的克隆及酵母功能验证 |
7.1 研究的内容与目标 |
7.2 材料与方法 |
7.2.1 实验材料 |
7.2.2 实验方法 |
7.2.2.1 RNA的提取、纯化及定量检测 |
7.2.2.2 cDNA第一链的合成 |
7.2.2.3 Jc CHS与JcGA20ox基因全长cDNA的克隆 |
7.2.2.4 Jc CHS酵母表达载体的构建、转化 |
7.2.2.5 Jc CHS重组酵母菌抗冷性功能验证 |
7.3 结果与分析 |
7.3.1 JcCHS与JcGA20ox基因全长c DNA的克隆 |
7.3.2 JcCHS与JcGA20ox的生物信息学分析 |
7.3.2.1 Jc CHS与JcGA20ox基因的初步分析 |
7.3.2.2 JcCHS与Jc GA20ox氨基酸序列功能元件鉴定 |
7.3.2.3 JcCHS与Jc GA20ox系统进化分析 |
7.3.2.4 JcCHS与Jc GA20ox的高级结构鉴定及分析 |
7.3.3 JcCHS酵母表达载体构建、转化及抗冷性评价 |
7.3.3.1 Jc CHS酵母表达载体构建及转化 |
7.3.3.2 Jc CHS重组酵母的抗冷性评价 |
7.4 讨论 |
7.4.1 JcCHS基因 |
7.4.2 JcGA20ox基因 |
第8章 PDI与MSRA基因的克隆及酵母功能验证 |
8.1 研究的内容与目标 |
8.2 材料与方法 |
8.2.1 实验材料 |
8.2.2 实验方法 |
8.2.2.1 RNA的提取、纯化及定量检测 |
8.2.2.2 cDNA第一链的合成 |
8.2.2.3 Jc PDI与Jc MSRA基因全长cDNA的克隆 |
8.2.2.4 Jc PDI酵母表达载体的构建、转化 |
8.2.2.5 Jc PDI重组酵母菌抗冷性功能验证 |
8.3 结果与分析 |
8.3.1 JcPDI与JcMSRA基因全长c DNA的克隆 |
8.3.2 JcPDI与JcMSRA的生物信息学分析 |
8.3.2.1 JcPDI与Jc MSRA的初步分析 |
8.3.2.2 JcPDI与Jc MSRA氨基酸序列功能元件鉴定 |
8.3.2.3 JcPDI与Jc MSRA系统进化分析 |
8.3.2.4 JcPDI与Jc MSRA高级结构鉴定及分析 |
8.3.3 JcPDI酵母表达载体构建、转化及抗冷性评价 |
8.3.3.1 Jc PDI酵母表达载体构建及转化 |
8.3.3.2 Jc PDI重组酵母的抗冷性评价 |
8.4 讨论 |
8.4.1 JcPDI基因 |
8.4.2 JcMSR基因 |
第9章 CBF1与CBF2基因的克隆及表达载体的构建 |
9.1 研究的内容与目标 |
9.2 材料与方法 |
9.2.1 实验材料 |
9.2.2 实验方法 |
9.2.2.1 RNA的提取、纯化及定量检测 |
9.2.2.2 cDNA第一链的合成 |
9.2.2.3 Jc CBF1与JcCBF2基因全长cDNA的克隆 |
9.2.2.4 Jc CBF1与JcCBF2酵母菌表达载体的构建 |
9.3 结果与分析 |
9.3.1 JcCBF1与JcCBF2基因全长cDNA的克隆 |
9.3.2 JcCBF1与JcCBF2的生物信息学分析 |
9.3.2.1 Jc CBF1与JcCBF2的初步分析 |
9.3.2.2 JcCBF1与JcCBF2功能元件及结构域鉴定 |
9.3.3 JcCBF1与JcCBF2酵母菌表达载体的构建 |
9.4 讨论 |
第10章 研究结论与展望 |
10.1 研究结论 |
10.2 研究展望 |
参考文献 |
致谢 |
课题资助及论文发表情况 |
(9)PRRSV不同致病性毒株非结构蛋白诱导靶细胞细胞因子差异表达的分子基础(论文提纲范文)
摘要 Abstract 目录 插图与附表清单 缩略词表 第一章 引言 |
1.1 国内外研究现状 |
1.2 研究目的和意义 |
1.3 研究内容和技术路线 |
1.3.1 研究内容 |
1.3.2 技术路线 |
1.4 研究目标 第二章 不同致病性PRRSV对靶细胞细胞因子表达的影响 |
摘要 |
2.1 前言 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 材料 |
2.2.2 方法 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 促炎细胞因子IL-1β和IL-8的表达 |
2.3.2 IL-10和TNF-α的表达 |
2.3.3 干扰素的表达 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 第三章 诱导靶细胞TNF-α差异表达的病毒蛋白的鉴定与分析 |
摘要 |
3.1 前言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 材料 |
3.2.2 方法 |
3.3 结果与分析 |
3.3.1 JXwn06和HB-1/3.9各个非结构蛋白表达效果的鉴定 |
3.3.2 各个非结构蛋白对猪TNF-α启动子活性的影响 |
3.3.3 不同致病性PRRSV对PAMs ERK信号通路的影响 |
3.3.4 抑制ERK信号通路的PRRSV非结构蛋白的鉴定 |
3.3.5 感染性克隆拯救病毒的鉴定 |
3.3.6 用嵌合病毒验证Nsp1β和Nsp11诱导TNF-α差异表达的作用 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 第四章 结论 第五章 创新点 第六章 文献综述 |
6.1 肺泡巨噬细胞(PAMs)分泌的细胞因子 |
6.1.1 干扰素 |
6.1.2 肿瘤坏死因子TNF-α |
6.1.3 白细胞介素10(IL-10) |
6.2 PRRSV的非结构蛋白 |
6.2.1 Nsp1α和Nsp1β |
6.2.2 Nsp2 |
6.2.3 其他非结构蛋白 |
6.3 展望 参考文献 致谢 作者简介 |
(10)去泛素化酶Ataxin-3在胃癌中的表达及作用地位的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
主要缩略语中英文对照 |
第一部分 Ataxin-3在胃癌中的表达及意义 |
前言 |
1 材料和方法 |
1.1 标本的来源及临床资料 |
1.2 技术路线 |
1.3 实验步骤 |
1.4 统计学处理 |
2 结果 |
2.1 Ataxin-3 蛋白在胃癌及上皮内瘤变组织中的表达 |
2.2 Ataxin-3 蛋白表达与胃癌临床病理学特征的关系 |
2.3 生存分析 |
2.4 Ataxin - 3 蛋白在不同胃癌细胞株中的表达 |
2.5 Ataxin-3 mRNA在胃癌中的表达 |
3 讨论 |
4 结论 |
第二部分 Ataxin-3在胃癌细胞中的功能学研究 |
前言 |
1 材料和方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验技术路线 |
1.3 实验步骤 |
1.4 统计学处理 |
2 结果 |
2.1 Ataxin-3过表达对胃癌细胞增殖的影响 |
2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
2.3 p53、p21及Bax增殖及凋亡相关因子mRNA表达的检测 |
2.4 Atax in -3 过表达对CHIP蛋白表达的影响 |
3 讨论 |
4 结论 |
第三部分 ATXN3-EGFP/SGC7901细胞模型的构建 |
前言 |
1 材料和方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验技术路线 |
1.3 实验步骤 |
1.4 统计学处理 |
2 结果 |
2.1 ATXN 基因过表达重组质粒的构建及鉴定 |
2.2 过表达ATXN3基因慢病毒载体系统的包装 |
2.3 转染 SGC7901 细胞后检测Ataxin- 3 表达 |
2.4 Ataxin-3 过表达稳定转染胃癌细胞克隆的筛选 |
3 讨论 |
4 结论 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
博士研究生期间发表的论文 |
致谢 |
四、人细胞骨架调节蛋白基因NELIN cDNA的克隆及特征分析(英文)(论文参考文献)
- [1]一个高度近视家系PRSS56突变鉴定及该基因与屈光不正相关性研究[D]. 秦曼. 昆明医科大学, 2021
- [2]LINC00612在膀胱癌中的生物学功能及机制研究[D]. 缪立英. 苏州大学, 2019(06)
- [3]多肽微阵列技术监测胶质瘤患者血清MGMT自身抗体的临床价值[D]. 吴海滨. 苏州大学, 2019(04)
- [4]鸡胸肌组织发育过程中差异基因的筛选及功能验证[D]. 田凯. 四川农业大学, 2018
- [5]长牡蛎左右外套膜的分子差异研究[D]. 李兴霞. 沈阳农业大学, 2017(08)
- [6]乙型脑炎病毒强弱毒毒力差异的分子机制研究[D]. 郑旭晨. 中国农业科学院, 2016(01)
- [7]番鸭就巢性状转录组、IncRNA的鉴定与分析[D]. 陈媛. 福建农林大学, 2016(04)
- [8]基于RNA-Seq解析小桐子抗冷性形成的分子机制及其关键基因的克隆与功能分析[D]. 王海波. 云南师范大学, 2015(04)
- [9]PRRSV不同致病性毒株非结构蛋白诱导靶细胞细胞因子差异表达的分子基础[D]. 何青. 中国农业大学, 2015(07)
- [10]去泛素化酶Ataxin-3在胃癌中的表达及作用地位的研究[D]. 曾丽霞. 广西医科大学, 2014(01)