一、人MAdCAM-1分子:基因、分子结构、分布与配体(论文文献综述)
马瑶芮[1](2021)在《新颖含吲哚结构的法尼醇X受体激动剂的设计、合成与活性研究》文中提出非酒精脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)以肝脏脂质蓄积为特点,伴随胰岛素抵抗。非酒精性脂肪肝炎(Nonalcoholic steato-hepatitis,NASH)作为NAFLD的炎症亚型,与肝纤维化、肝硬化以及肝细胞癌(hepatic cellular cancer,HCC)等不良预后密切相关,是一个影响人类生命健康的重大流行疾病,也是一个治疗手段严重缺乏的疾病领域。遵循NASH发病机制相关的“二次打击”假说,目前对NASH药物治疗靶点的选择主要集中在代谢调节、抗炎以及抗纤维化三个方面。法尼醇X受体(Farnesoid X receptor,FXR)是以胆汁酸为天然配体的核受体家族成员,能够调节胆汁酸、葡萄糖以及脂肪的代谢过程和体内稳态。FXR已经被公认为是治疗NASH的靶标。以奥贝胆酸为代表的甾体类FXR激动剂在临床试验中被证实了抗NASH效果,但同时也表现出了瘙痒和血清胆固醇升高等副作用。现存小分子FXR激动剂普遍存在的问题包括药物毒性副作用、低溶解度和较差的药代动力学性质。已报道的FXR激动剂类化合物在结构上有两个明显的特征:一是通常都具有较强的梳水性,与配体结合腔相适应并通过梳水结构稳定FXR活性构象;二是分子中存在至少两个氢键供体或受体,通过极性相互作用来固定配体在结合腔中的构象。此外,FXR受体结合腔可容纳多种不同形状和大小的结构骨架。WAY-450是一个具有高活性(EC50=2 n M)和高选择性(10μM浓度下与其他受体无显着交叉反应)的非甾体类小分子FXR激动剂,已经被证明能够在血脂异常、动脉粥样硬化以及非酒精性脂肪肝病等多种代谢相关疾病的动物模型中产生治疗效果,并由于其出色的降血脂效果而进入过临床I期研究。但是,该分子结构具有高度疏水性和高度平面化的特点,因而水溶性较差,并由于非安全性问题终止了临床试验。本论文以WAY-450为基础,分别采用了三个药物设计策略,设计并(尝试)合成溶解度改善的活性化合物。一是尝试制备磷酸酯前药,通过在结构中引入极性且可电离的前药基团增加药物溶解度;二是通过可以旋转的侧链代替原本以酰胺键连接的侧链,降低分子的平面性;三是利用“诱导-契合”效应进行了全新的分子设计,得到了含有两个柔性侧链的吲哚衍生物。我们共合成了39个新颖的含吲哚结构的化合物,发现了一个具有FXR激动效能的分子系列。其中活性最好的化合物在分子水平的FXR络合活力已经达到446 n M,为下一步的研究奠定了基础。我们后续将对上述活性化合物系列进行优化和系统的活性分析和研究,目标是得到具有高活性和高选择性以及良好体内药代动力学性质的FXR激动剂类抗NASH药物。
秦子健[2](2021)在《机器学习方法用于丙型肝炎病毒抑制剂生物活性的预测研究》文中认为丙型肝炎由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起。HCV感染者有很高的风险发展为严重肝病,包括肝硬化和肝纤维化等,而这些严重肝病通常会导致肝细胞癌。据世界卫生组织统计,全球的HCV感染者超过7000万人,且每年在以125万人的数量增加。目前还没有有效对抗HCV的疫苗,且近年来HCV的多基因型与多突变型,使得HCV感染的治疗愈加困难。本论文主要采用计算机辅助药物设计的研究方法,以丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶和NS5A蛋白这两个成药靶点为研究重点,利用化学信息学和机器学习的方法进行抑制剂的活性预测和抑制剂的虚拟筛选研究,利用分子动力学模拟方法进行抑制剂对突变型蛋白的耐药性机理研究,取得了较好的预测效果。此外,利用化学信息学和机器学习的方法对抗炎靶标环氧合酶-2建立了生物活性高低分类模型,取得了较好的分类效果。论文主要研究内容为:(1)使用多元线性回归、支持向量机和随机森林算法构建了 HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂的定量构效关系模型。收集512个抑制剂及生物活性IC50值构建数据集,计算每个分子的CORINA全局描述符和二维自相关描述符,使用多元线性回归(MLR)、支持向量机(SVM)和随机森林(RF)三种机器学习方法建立模型。最优SVM模型ModelD4对测试集的预测决定系数(r2)为0.843、标准误差(SEE)为0.647;最优RF模型ModelC6对测试集的预测r2为0.847、SEE为0.635。对两个最优模型的应用域分析,得知其对训练集和测试集抑制剂的覆盖率均大于97%,说明模型的预测结果可信。此后,将数据集拆分成非大环抑制剂子数据集和大环抑制剂子数据集,使用相同的流程基于子数据集建立模型。结果显示出所有的子模型的预测效果均优于总模型。最终得到两组模型可作为有力的虚拟筛选工具:即SVM总模型ModelD4、非大环抑制剂子模型ModelLB2和大环抑制剂子模型ModelMD2;RF总模型ModelC6、非大环抑制剂子模型ModelLB3和大环抑制剂子模型ModelMD3。通过对模型所用分子描述符的分析,我们得知π原子电荷、孤对电子的原子电负性是较为重要的理化性质,可旋转键个数是连接非大环抑制剂和大环抑制剂之间的桥梁。(2)使用定量构效关系模型方法和三维形状与静电相似性比对方法进行了 HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂的虚拟筛选。筛选了 Specs数据库和ChemDiv数据库,两数据库总计超过1 81万个小分子。使用两种方法平行对数据库进行虚拟筛选,第一种方法是使用定量构效关系模型预测的方法,通过之前建立的三个SVM模型对数据库中所有分子的生物活性IC50值进行预测,最终得到367个平均预测活性IC50低于100 nM的非大环分子;第二种方法是基于配体化合物的三维形状与静电相似性比对的方法,将上市药物对应的晶体结构中的配体构象作为模版分子构象,找出数据库中与模版分子构象在三维形状、化学基团和静电相似性之和较高的分子,最终得到相似性指数高于1.2的119个非大环分子和22个大环分子。两种筛选方法共筛选得到508个分子。随后,对这508个分子的进行结构聚类,仅保留每个聚类中心预测活性最高的85个分子。通过手动分类,将85个分子根据它们的分子骨架划分为13类,保留了每类骨架中预测活性最高的分子作为候选分子。最后,通过分子对接、分子动力学模拟、结合自由能计算和结合模式分析,进一步对虚拟筛选结果进行验证,得到3个可以与NS3/4A蛋白酶具有较强相互作用的候选分子,它们可用于进一步研究。(3)使用比较分子力场分析(CoMFA)方法和比较分子相似性指数分析(CoMSIA)方法构建了 HCVNS5A蛋白吲哚四环类抑制剂对野生型与突变型蛋白活性的三维定量构效关系模型。收集了 196个吲哚四环类抑制剂以及它们的三组生物活性,即野生型GT-1a、突变型GT-1a Y93H和突变型GT-1a L31V的EC90值构成三组数据集。使用OMEGA程序对每个抑制剂生成了 600个构象,并使用ROCS进行分子叠合。使用CoMFA和CoMSIA方法分别建立模型。在建模过程中,我们定义了四个参数选择规则和一个过训练评价公式来选择最佳参数。对于三组数据集GT-1a、GT-1a Y93H和GT-1a L31V,最优模型的测试集预测决定系数(r2)分别为0.682、0.779 和 0.782,标准误差(SEE)分别为 0.418、0.608和0.560。通过对最优模型的等势图分析,总结出在药物艾尔巴韦(elbasvir)分子Z基团对位引入一个相对较小、非负电、疏水、无氢键受体的基团,将Z基团的苯环替换为杂环,在四环核心基团上引入体积较小的吸电子取代基,在缬氨酸的异丙基中引入氢键受体且不要替换为体积过大的基团,在脯氨酸中引入疏水性基团且不要引入氢键受体和负电基团可以同时提高抑制剂对野生型蛋白和两个突变型蛋白的生物活性。(4)利用分子对接和分子动力学模拟方法完成了 HCVNS5A蛋白上市药物艾尔巴韦对突变型Y93H和L31V的耐药性机理研究。结合PDB和NCBI数据库,手动补全NS5A蛋白缺失的N端残基,构建完整的野生型NS5A蛋白的三维结构。随后手动突变构建了 Y93H和L31V两种单突变型蛋白的三维结构。将药物分子艾尔巴韦(elbasvir)分别对接至三个蛋白的结合口袋中,构建初始复合物体系。使用Amber程序对三组复合物体系平行进行分子动力学模拟,包含能量最小化、加热、恒压、平衡和80ns的生产模拟。通过对模拟过程中RMSD的变化、结合自由能的计算、结合自由能的分解和结合模式的分析,从分子角度推断了两突变导致艾尔巴韦分子抑制活性降低的主要原因:对于Y93H突变,由于H93与药物分子的咪唑发生静电排斥,使药物分子在口袋中发生较大偏移和翻转,从而降低了抑制活性;对于L31V突变,由于V31使得蛋白linker部分的柔性增大,使得linker与药物分子的帽子基团相互作用减弱,从而降低了抑制活性。(5)使用支持向量机和随机森林算法构建了环氧合酶-2(COX-2)抑制剂的生物活性分类模型,并使用K均值和t分布随机邻域嵌入算法进行分子骨架聚类研究。收集2925个COX-2抑制剂和生物活性IC50值,使用1 μM作为阈值将抑制剂定义为高、低活性,使用MACCS指纹、ECFP4指纹和CORINA分子描述符表征每个分子,使用支持向量机(SVM)和随机森林(RF)两种机器学习算法建立模型。此外,我们进一步将2925个抑制剂以0.1μM和10 μM作为阈值定义为高、中、低活性,并去除中间活性抑制剂,使用剩余的1630个抑制剂建立活性分布更加明确的分类模型,得到的最优模型是以ECFP4指纹建立的随机森林模型,其对外部测试集的马修斯相关系数(MCC)达到0.68。以MACCS指纹为输入,使用K均值聚类算法和t分布随机邻域嵌入算法将抑制剂聚类为8个子集。通过描述符分析和聚类分析,得知芳香族氮原子、卤素原子、含硫双键和含氧双键对生物活性有利,而羟基、非芳香性双键氮原子对生物活性不利。综上所述,本论文以HCV的NS3/4A蛋白酶和NS5A蛋白这两个药物靶标作为研究重点。对于NS3/4A蛋白酶靶点,我们使用基于配体的药物筛选方法建立抑制剂的生物活性预测模型并用于虚拟筛选,用于发现具有新颖骨架的候选分子。对于NS5A靶点,我们使用基于配体和基于受体的药物设计研究方法,探究上市药物分子对野生型和突变型蛋白生物活性的差异,探索抑制剂对突变产生耐药性的原因。此外,本论文涉及第三个药物靶标,即对抗炎药物靶标COX-2进行了化学信息学相关研究。本论文的研究工作对基于HCVNS3/4A蛋白酶、HCVNS5A蛋白和COX-2的药物设计具有一定的参考价值。
谭小芹[3](2021)在《基于虚拟筛选和深度生成模型的药物发现与优化研究》文中提出新药研发面临着诸多挑战,存在成本高、耗时长、风险高等痛点,也导致了新药开发的回报率逐年降低。计算机辅助药物设计以计算化学为基础,融合分子力学、量子力学、结构生物学等学科发展了一系列计算模拟分析方法,在药物研发中的先导化合物的发现优化、化合物ADME/T预测等方面有着广泛的应用。在海量组学数据积累的背景下,人工智能技术以其强大的表征、学习及分类能力在新药研发领域引起了广泛的关注,并在新药研发的不同阶段有着广泛的应用。虚拟筛选是计算机辅助药物设计的传统方法,在新药研发中有着诸多成功案例。随着计算方法的不断提升,虚拟筛选方法也得到了一定的发展。我们在第一章第一节中概述了虚拟筛选方法的分类与发展。人工智能技术在新药研发的诸多领域有着广泛的应用,如蛋白质结构预测、分子的设计及优化、靶标预测、化学反应预测、药物性质预测等。新药研发的目标是发现具有理想药理学性质的化合物,深度生成模型在从头分子设计中展现了巨大的应用前景,受到了学术界及工业界的广泛关注。本文在第一章第二、三节中概述了人工智能技术在药物设计中的发展及应用,并重点阐述了深度生成模型的方法、发展及应用。深度生成模型作为药物设计领域中的新兴工具,通过强大的表征学习能力直接生成具有期望性质的新分子,有着巨大的应用潜力。癌细胞的特征之一是能量代谢异常,即使在有氧条件下,癌细胞仍然通过糖酵解的方式进行能量供应,该现象为瓦博格效应。GAPDH参与糖酵解过程的第六步,是关键限速酶。有大量研究表明,对GAPDH的抑制作用可以阻止癌症的进一步发展,通过抑制GAPDH酶活性进行抗肿瘤治疗具有重要的意义与研究价值。在第二章中我们建立了基于结构的虚拟筛选模型,并通过该模型筛选得到活性化合物DC-5163,其IC50为176.3 n M。我们通过分子模拟,提出了该分子与GAPDH可能的结合模式。并利用相似性搜索法从商业库购买了一系列化合物进行构效关系分析。通过细胞增殖抑制实验和细胞凋亡实验,我们发现DC-5163能够抑制癌细胞增殖,并且对正常细胞无影响。DC-5163通过抑制癌细胞内的GAPDH酶活,阻断癌细胞的糖酵解过程,诱导癌细胞凋亡,从而达到抗肿瘤治疗效果。精神分裂症影响着全世界1%人口的生活与健康,需要靶向多种GPCRs的药物来调节其复杂的神经精神功能。传统的药物发现方法具有一定的局限性,如高通量筛选工作量大、成本高昂、虚拟筛选库有限等,难以实现多靶点合理设计。在第三章中,我们基于人工智能技术与大数据,建立了精神病类多靶点药物自动设计平台。我们首先基于多任务神经网络建立了小分子的活性预测平台,然后基于循环神经网络建立了分子生成模型,进行多靶点GPCR分子库的自动设计。我们通过对生成的分子进行预测活性、可合成性、类药性等多方面评估过滤,以此形成生成-虚拟筛选的迭代循环,不断提高分子活性,最终由该平台得到了候选化合物8。化合物8具有多靶点平衡活性,剂量依赖性逆转了PCP诱导的小鼠高自发活动,是非常有前景的精神病类候选化合物。保留特定分子骨架作为其核心结构并进行后续的分子优化设计是获得潜在候选药物的有效途径。DDR1的失调与许多人类疾病有关,包括炎症性疾病(动脉粥样硬化、骨关节炎和器官纤维化)、胰腺癌、胃癌和非小细胞肺癌等。我们在之前对FGFR的研究中,发现化合物1对DDR1有着微弱的抑制活性。通过分子模拟研究发现,化合物1与DDR1蛋白的铰链区形成了三个关键的氢键作用,该化合物的尾部与侧链部分有较大的扩展及优化空间。在第四章中,我们基于深度生成模型对化合物1进行了分子结构的优化设计。我们基于序列到序列(Seq2Seq)模型建立了分子生成模型,将分子骨架输入给该模型,该模型可以为骨架上的每个附着(修饰)点生成装饰片段,直到所有的附着点都被装饰完,以此生成一个基于骨架的虚拟分子库。后续我们基于激酶谱预测模型和分子对接,对该分子库进行虚拟筛选。最终筛选得到化合物2,该化合物有着杰出的激酶选择性,抑制细胞中促炎因子的表达和DDR1自磷酸化。化合物2在体内对DSS诱导的炎症性肠病有显着的治疗保护作用,药效与阳性药相当。
金玲敏[4](2021)在《OPAHs急性毒性和芳香烃受体活性的计算模拟》文中研究指明含氧多环芳烃(OPAHs)是由化石燃料不完全燃烧,或由PAHs化学氧化、光化学氧化或生物氧化形成的一类新污染物。迄今,已有许多OPAHs在环境中被检出,部分OPAHs具有发育毒性、致突变性和致癌性。但是,仍有很多OPAHs缺少毒性数据以及OPAHs产生毒性的机制未可知。定量结构-活性关系(QSAR)可以预测OPAHs的毒性,以减少昂贵、耗时、费力的毒性测试。分子对接可以预测模拟OPAHs与生物大分子之间的作用力。本文建立了QSAR模型以预测OPAHs斑马鱼胚胎急性毒性、重组酵母中的人体芳香烃受体(h AHR)活性和小鼠肝癌细胞中的小鼠芳香烃受体(m AHR)活性。通过优化分子结构,计算了32种OPAHs量子化学描述符和Dragon描述符,使用多元线性逐步回归法建立了斑马鱼胚胎急性毒性(log EC50)的QSAR模型(R2为0.781),发现OPAHs的得失电子能力和疏水性是产生斑马鱼胚胎急性毒性的主要因素。使用相同方法建立了30种PAHs和OPAHs在重组酵母中的h AHR活性模型和20种PAHs和OPAHs在小鼠肝癌细胞中的m AHR活性模型。在重组酵母中表达h AHR活性的模型表明(R2为0.880),分子的疏水性是影响h AHR活性表达的主要因素。在小鼠肝癌细胞中表达m AHR活性的模型表明(R2为0.817),分子极性是影响m AHR活性表达的主要因素。以上3个QSAR模型的拟合优度评价、内部验证和外部验证结果说明模型均具有较好的稳健性和预测能力。采用Williams图表征了模型的应用域,表明模型均具有较好的适应性。分子对接探索PAHs和OPAHs与m AHR之间的相互作用力。使用Vina软件对m AHR蛋白质与PAHs和OPAHs进行分子对接,得到化合物的结合能与m AHR活性呈强相关性,即结合能越大的化合物,m AHR活性越大。氢键和疏水相互作用是PAHs和OPAHs与m AHR之间可能形成的作用力。
李叙潼[5](2021)在《基于深度学习的抗肿瘤药物作用机制研究》文中研究说明随着近年来生命科学领域蓬勃发展,人们对肿瘤疾病机制的认知逐渐加深。癌基因依赖理论认为,癌症细胞生存特异性地依赖某个基因,该基因的失活会导致癌细胞出现生长抑制或凋亡。据此,我们已找到多种癌症的依赖性癌基因,开发针对这类基因分子靶向药物,例如靶向蛋白激酶的小分子抑制剂,是目前抗肿瘤治疗领域的发展方向。基于高通量的基因组和转录组学等技术的得到的癌细胞系的分子特征,肿瘤药物治疗已经进入了分子分型指导的个性化治疗时代,但肿瘤药物治疗的响应率仍然有限。在精准医疗的大框架下,将人工智能(AI)技术引入抗肿瘤药物及其作用机制的研究,深入挖掘药物对肿瘤治疗靶标的活性和肿瘤细胞系的敏感性,是开发高效的新型肿瘤药物的方向。AI药物发现是药学和人工智能的深度交叉。无论对肿瘤还是其他疾病而言,传统的药物研发方式长期面临着研发周期长,失败率高,成本高等局限。高性能计算的飞速发展,人工智能算法的不断优化以及化学和生物学数据的大量积累,为AI技术在药物研发领域应用提供了基础。论文第1章对AI技术在药物发现领域的发展和应用展开了详细的讨论。随后,我们从两个方面讨论了基于AI的抗肿瘤药物研究。第2章中,我们使用多任务深度神经网络模型预测小分子化合物在人类激酶谱中的多向药理学效应和选择性。第3章中,基于组学数据和蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络,我们构建了图注意力网络模型,研究药物的体外细胞系敏感性和作用机制。蛋白激酶是癌基因依赖的主要靶标类型,开发激酶特异性的小分子抑制剂是目前抗肿瘤治疗领域的主要挑战。基于大规模生物活性数据和多任务深度神经网络(MTDNN),我们开发了一种针对激酶的虚拟筛选模型,用于预测激酶小分子抑制剂与391种激酶的相互作用情况。激酶抑制剂具有广泛的交叉反应性,使之成为高度相关的预测任务。借由MTDNN的迁移学习效果,所获得的模型具有出色的预测能力,与过去报道的单任务随机森林方法相比始终显示出更高的性能,特别是对于活性数据不足的激酶任务仍能显示出令人振奋的高预测性。进一步地,我们对未知广谱激酶谱活性的上市和在研激酶抑制剂进行预测,并辅以严格的实验验证。结果显示,在1,410个激酶-化合物对上,模型给出了高质量的预测,au ROC达到0.75,并且成功地预测许多新颖的和治疗性的“脱靶”活性。基于预测得到的激酶谱,MTDNN还可用于描述化合物在激酶谱上的整体选择性,激酶亚家族特异的选择性及对某些疾病特异的选择性。使用训练好的MTDNN模型,我们搭建了小分子全激酶组多药理学作用的在线分析平台Kinome X。Kinome X可以对小分子在全激酶范围内的活性进行预测,并根据预测结果给出对小分子整体和激酶亚家族特异的选择性的分析。总体而言,MTDNN及基于其搭建的Kinome X提供了能够全面的研究小分子的激酶组活性和多药理学效应的有效手段,能为设计新颖的激酶抑制剂或药物重定向提供参考,并且对探索过去研究较少的激酶具有实用价值。在精准医疗的大背景下,开发基于肿瘤患者的基因组信息预测有效治疗策略的计算模型,是肿瘤治疗领域的发展方向。对此,我们使用图注意力网络(GAT)处理PPI网络,将癌细胞系的转录谱作为节点特征,用以构建药物细胞敏感性预测模型。我们使用标准化的表达谱(BEXP)作为细胞特征,跨细胞的共识基因签名(SIGN)作为药物特征,用以预测相应的药物剂量响应(AUC)。为了基于先验的生物背景对表达谱进行系统性的整合,我们采用GAT处理PPI网络,建立了两个端对端的模型,使用药物特征同时预测多个细胞系响应的多任务模型MTGAT,和使用药物和细胞系组合特征预测对应响应的多模态模型MMGAT。两种不同的框架对药物响应均有良好的预测性,预测效果全面超越了基准DNN模型。进一步地,我们使用GAT的注意力机制探索了模型的可解释性,发现注意力系数与生物机制之间存在关联。分析表明,具有更高局部注意力系数的邻居节点基因可能更多地与中心节点基因的转录和生物功能相关,而全局注意力可以有效富集到靶向药物的靶标蛋白。基于GAT的药物敏感性预测模型有助于发现未知的药物和细胞相互作用,进而发现药物响应的预测因子来揭示药物敏感性的生物机制,有希望助力抗肿瘤药物的发现和重定向。
钟姝凝[6](2021)在《β-葡萄糖苷酶对人参皂苷生物转化及其相互作用机制研究》文中进行了进一步梳理人参作为传统中药的瑰宝,其医疗及保健功效显着,在药物和新资源食品开发中得到广泛应用。作为产生药效的物质基础,人参皂苷是人参的主要活性成分,其中含量占多数的称为主要人参皂苷,如人参皂苷Rb1,当其脱去部分/全部糖基后所得产物,称为稀有人参皂苷,具有更强的活性与更佳的生物利用度。β-葡萄糖苷酶具有催化烷基糖苷、芳基糖苷等分子糖链末端非还原性β-D-葡萄糖苷键水解的作用,可将糖基化的主要人参皂苷生物转化为稀有人参皂苷。发掘新型β-葡萄糖苷酶资源并对其相关性质及功能进行分析,阐明β-葡萄糖苷酶在催化反应过程中与底物人参皂苷的结合与相互作用模式,探究稀有人参皂苷作为细胞核受体调节剂的构-效关系,对理解β-葡萄糖苷酶作用于非典型底物人参皂苷Rb1的作用机制,以及拓展稀有人参皂苷的生理活性有重要意义。本文主要研究内容包括如下几个方面。(1)以GH1家族中Paenibacillus polymyxa来源的β-葡萄糖苷酶(Gen Bank:M60211.1),对密码子优化使其更易原核表达。随后对该基因序列bgl B进行基于PCR法的全基因合成,连接pET-28a(+)载体以构建重组质粒pET-28a(+)-bgl B,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),于30℃,220 rpm条件下,经IPTG诱导在菌体细胞破碎后的上清液中获得表达产物,即原核表达的重组β-葡萄糖苷酶。利用Ni-NTA层析法对粗酶液进行纯化,鉴定重组β-葡萄糖苷酶蛋白质单体的分子量为52 k Da,蛋白质浓度为0.479 mg/m L,纯度大于95%。采用多种生物信息学软件及在线工具,分析目标β-葡萄糖苷酶的理化性质,该酶无跨膜结构域,无信号肽,整体呈亲水性,分析了蛋白质二级结构组成,三级结构模型合理,蛋白质结构中共含有4个磷酸化位点,发现9个开放阅读框中ORF2序列含有糖苷水解酶家族GH1的特征序列,亚细胞定位于细胞质。对β-葡萄糖苷酶的编码氨基酸序列,进行多序列比对分析及进化关系分析,可知糖苷酶之间的同源性存在差异,其催化功能的活性中心依然保持高度相似性。总的来说,通过全基因合成及原核表达纯化,获得序列及结构信息明确的β-葡萄糖苷酶,结合生物信息学分析,有助于理解该酶的进化关系、相关性质及功能。(2)利用多种光谱实验方法及分子模拟,探究β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb1相互作用模式,对纯酶、β-葡萄糖苷酶-人参皂苷Rb1复合物进行表征。荧光光谱分析了在不同温度条件下,随着人参皂苷Rb1浓度的增加,β-葡萄糖苷酶的自发荧光减弱,其中的固有荧光氨基酸残基所处微环境发生变化。在280 nm波长处,峰值出现轻微蓝移,说明β-葡萄糖苷酶在基态更加稳定,获得Stern-Volmer方程(y=0.00754x+1.0984,R2=0.9941),猝灭常数KSV为8.37×103L/mol,速率常数Kq为8.37×1011L/mol×s,KSV随温度升高而增大,说明该过程属于静态猝灭。同步荧光光谱分析了当△λ=15及60 nm时,由不同氨基酸残基引起荧光强度的变化情况,并与三维荧光光谱共同佐证了一致的结论。紫外-可见吸收光谱分析了Rb1浓度升高后,酶中Trp疏水基团被更多的包裹,酶-Rb1之间形成一个新的共轭体系,二者之间发生非辐射能量转移,并增加新的π-π*跃迁。圆二色光谱分析了Rb1的加入与结合,使酶的二级结构发生变化。LSPR分析了当β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb1形成稳定的1:1复合物时,平衡解离常数(KD)为5.24×10-4(±2.35×10-5)mol/L,ka为29.7(±6.62×102/mol×L-1×s),Kd为1.56×10-2(±2.17×10-5)/s。FTIR分析了β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb1复合物的结构变化。动态光散射分析了Rb1的加入使β-葡萄糖苷酶的流体力学半径与酶溶液的Zeta电位发生的变化。分子对接分析了人参皂苷Rb1与β-葡萄糖苷酶的结合构象(-8.9 kcal/mol)、结合位点、氢键作用及热点氨基酸残基。将β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb1复合物提交100 ns分子动力学模拟,可知该体系整体波动较小,总结合自由能为-50.86kcal/mol,说明二者具有较好的结合。(3)在对重组β-葡萄糖苷酶的酶学性质探究,及酶对人参皂苷Rb1的生物转化分析中,测定了粗酶液经Ni-NTA柱纯化后,酶的比活力提高了15倍,得率为51.0%,水解p NPG比活力达到12.4 U/mg。重组β-葡萄糖苷酶的Km和Vmax值分别为0.743 mmol/L和3.14×104μmol/min/mg。Kcat/Km为3.813×103/s/mmol/L,说明对典型底物p NPG具有更高特异性及催化效率,并探究了该酶的底物特异性及催化环境对重组β-葡萄糖苷酶的影响,结果说明该酶在pH范围3.0至9.5内具有活性,最高活力在pH 6.5;温度范围20℃至70℃内都有活性,于40℃具有最高活力。探究了金属离子及化学试剂对酶活力的影响,结果显示一价金属Na+、K+、Li+,二价金属Ba2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+对重组β-葡萄糖苷酶的活力影响轻微;三价金属Al3+及重金属Pb2+、Ag+的加入使酶活力受到较大程度的抑制;醇类及DMSO对该酶活力影响较小,而SDS及EDTA可以抑制80%以上的酶活。对酶学性质的了解,为后续对酶的开发应用奠定基础。建立了能够同时测定Rb1、Rd、F2、CK等人参皂苷的超高效液相色谱方法与三重四极杆线性离子阱串联质谱法,对人参皂苷的成分及结构组成进行判别。对于酶转化人参皂苷的反应过程,以单体标准品人参皂苷Rb1为底物,在最优条件下(pH 6.5;温度40℃;Rb1浓度1 mg/m L),酶活力10 U的重组β-葡萄糖苷酶可以转化底物人参皂苷Rb1,水解C-3位葡萄糖基及C-20位的β-D-吡喃葡萄糖基,转化路径为Rb1→Rd→F2→CK。催化反应72 h时,人参皂苷CK的产率为41.85%,人参皂苷的F2产率为20.57%,人参皂苷Rb1的总转化率为95.70%。(4)以人参皂苷的主要代谢产物及作为结构基础的四种人参皂苷,20(S,R)-原人参二醇[PPD(S,R)]和20(S,R)-原人参三醇[PPT(S,R)]作为研究对象,探究人参皂苷作为雌激素受体调节剂的构-效关系。重组质粒p GEX-4t-1-ERα-LBD转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,利用GST亲和层析柱纯化,获得目标蛋白ERα-LBD,经SDS-PAGE分析其为62.8 k Da的可溶性蛋白质,即对应含有hERα配体结合域的GST融合蛋白。荧光偏振体外结合与竞争实验中,受试人参皂苷均表现出与hERα-LBD的剂量依赖性结合,Kd值在1260.64μmol/L-1716.19μmol/L之间,结合强度大小顺序为PPD(S)>PPD(R)>PPT(S)>PPT(R)。双荧光素酶报告基因实验中,构建pc DNA3.1(t)-hERα质粒,将ERα的反应原件ERE装载于质粒ERE-luc上,并以p RL-TK质粒作为内参,以荧光信号比值(Fluc/Rluc)作为经标准化后的ERα转录活性。双荧光素酶报告基因结果显示,hERα被PPD(S,R)和PPT(S,R)以剂量依赖的方式激活,能够上调由ERα介导的基因转录,最大增加4倍。人参皂苷在微摩尔浓度下可以激活ERα转录,表现出比E2(纳摩尔浓度)弱的效力。利用分子对接技术分析了人参皂苷-hERα-LBD复合物中受体-配体之间的相互作用及结合模式。分子对接结果与实验测定IC50值具有良好的相关性(R2=0.94),表明分子动力学模拟可用于预测新型生物活性化合物对靶受体的结合效力。
郑路倩[7](2021)在《新型自剪切型核酶twister-sister和hatchet的结构以及催化机制研究》文中进行了进一步梳理核酶是一类具有催化活性的非编码RNA分子,在细胞内参与多种重要的生命活动,包括t RNA加工、内含子剪切、蛋白质合成等。根据催化机制不同,核酶可被分为两类:金属依赖型核酶和自剪切型核酶。已有研究表明,自剪切型核酶一般采用广义酸碱催化机制进行位点特异性的自剪切。目前,已发现的自剪切型核酶一共有十类,hammerhead、HDV、VS、hairpin、glm S、twister、pistol、twister-sister、hatchet以及hovlinc。基于自剪切型核酶的催化特性,研究人员开发了多种人工系统应用于RNA体外转录、体内基因表达调控、基因编辑等。而自剪切型核酶的三级结构是研究其催化机制以及开发其相关应用的重要基础。本论文通过X-射线晶体学的方法分别解析了twister-sister核酶和hatchet核酶的三维空间结构,并对其催化机制进行了探讨。为了拿到全长twister-sister核酶的结构,我们在自剪切位点处引入了脱氧核糖核苷酸d C62(2’-H),通过X-射线晶体学的方法,最终解析了分辨率为2(?)的全长twister-sister核酶的三维空间结构。通过三级结构分析,我们发现原本分散在不同结构单元L1和SL4上的高度保守碱基在三维空间结构中可以形成远距离相互作用。在酶切位点处的碱基C62和A63呈现伸展构象,其中,A63通过碱基堆积作用以及氢键相互作用被锚定在结构内部,而C62指向结构外侧,构象相对灵活。此外,我们发现酶切位点附近碱基G5的N1H与酶切位点处磷酸根的非桥接氧原子形成氢键相互作用,此结构特征同样存在于twister核酶。将G5突变为A、U或者C均会严重破坏twister-sister核酶的活性,证明此碱基在其催化反应中十分重要,但基于现有结果,我们尚无法判断其是否直接参与了催化过程。另外,在酶切位点处存在一系列镁离子,这些镁离子参与了酶切位点复杂氢键网络的形成。其中一个镁离子M2的一个配位水与模拟的2’-OH的距离为3(?),此配位水有可能在催化过程中发挥广义碱的作用。twister-sister核酶的三级结构展示了其整体结构特征以及催化口袋结构特征,为研究其催化机制提供了重要的结构基础。在同期发现的三类新型自剪切型核酶中,hatchet核酶是唯一一类酶切位点位于近5’端的核酶。本文解析了分辨率为2.1(?)的hatchet核酶的3’产物结构,由于其保守序列以及主要的二级结构均位于3’产物,因而此结构可认为代表了全长hatchet核酶的整体结构。hatchet核酶3’产物的整体三级结构由两个近乎平行的长螺旋组成,环区L1与L3之间以及高度保守碱基之间形成了远距离相互作用从而稳定了整体结构。在三级结构中,原本位于近5’端的酶切位点经过折叠后处于整个结构的中心并被高度保守碱基包围。另外,我们发现催化口袋处形成了一个空穴,其大小足够容纳酶切位点处U1与C(-1)之间易断裂的磷酸根以及碱基C(-1),基于此,本文建立了全长hatchet核酶处于酶切前构象的结构模型,模型中C(-1)以及酶切位点处的磷酸根可以与一系列高度保守碱基形成相互作用。其中,我们发现高度保守碱基G31与C(-1)的2’-OH之间的距离在形成氢键相互作用的范围内,而将G31突变为c7G31后会彻底破坏hatchet核酶的活性,这表明G31可能在催化过程中充当广义碱的角色。基于上述结果,我们进一步研究了hatchet核酶的催化性质。我们的研究不仅展示了hatchet核酶的整体结构特征以及催化口袋组成,还为进一步获得其全长结构以及明确其催化机制奠定了必要的结构基础。
郭文婷[8](2020)在《Salamo型荧光化学传感器和配合物的合成、表征及其在环境检测与抗癌活性中的应用研究》文中认为由于人类对自然资源的不合理开采以及对有毒物质的任意排放,导致环境中出现了大量的污染物,这些污染物很容易扩散至水体、土壤或者空气中,并且长期残留,具有“伪持久性”。更为严重的是这些污染物会通过食物链进入生物体。由于在生物体中的累积和放大效应,这些污染物即使是在相当低的浓度,也会对人类健康构成威胁。研究已经证实了肿瘤和神经系统等重大疾病等均与环境中的污染物存在某种关联。因此,通过发展先进的检测方法来检测与监测环境污染物是明确污染源、研究污染物作用机理、预测污染进程、解决环境问题、改善环境条件、保护人体健康的前提。与其它分析方法相比,荧光分析法因具有灵敏度好、检测快速、准确度高和抗干扰能力强等优点,而成为分析检测和跟踪目标污染物最有效和常用的方法。Salamo型化合物因具有良好的稳定性,结构易于优化,制备过程可控以及与金属离子配位能力强等优点,在催化和传感领域表现出了潜在的应用前景。基于此,通过对Salamo型化合物的分子结构进行衍生化,得到了两种半Salamo型单肟配体,分别用这两种配体与铜离子配位从而组装成了相应的配合物及配位聚合物,同时研究了这些配合物在癌症治疗方面的应用。此外,制备了六种结构特异的Salamo型荧光化学传感器,致力于研究其在环境污染物分析检测和环境修复等方面的应用,量子化学理论计算结果与设计思路相一致。研究内容共分为以下六个部分:(1)首次报道了半Salamo型配体HL1的铜(II)配合物的单晶结构[Cu2(L1)2(μ-OAc)2],研究发现铜(II)配合物是通过分子间的氢键相互作用自组装形成一个向内无限延伸的三维的超分子构型。模拟细胞微环境的实验证明了铜(II)配合物可以降低GSH水平,改善肿瘤微环境,且具有协同增强化学动力治疗(CDT)效果。细胞毒性研究表明铜(II)配合物可实现在极低浓度下对HeLa细胞的有效杀伤。(2)以半Salamo型配体HL2为前驱体,经Cu(II)催化作用其O-N键断裂形成的配体HL3与醋酸铜(II)反应得到铜(II)配位聚合物∞[Cu(L3)]。体外实验表明该铜(II)配位聚合物能被肿瘤微环境中的GSH分解和还原得到Cu(I),Cu(I)与肿瘤细胞中过量表达的H2O2发生芬顿反应产生羟基自由基,从而提高了细胞内ROS水平,达到高效的CDT。本研究为开发Salamo型配位聚合物作为增强CDT的潜在抗癌药物提供了新的策略。(3)首次合成了不对称单Salamo型荧光探针G1,并用于高选择性检测硼酸盐和甲醛。其检测机理是G1与硼酸盐发生配位反应关闭了G1的激发态分子内质子转移(ESIPT)过程,从而达到了对硼酸盐比率检测。此外,G1可以用于检测和确定被污染的水体和土壤中硼酸盐的含量,从而在工业废水监测中有良好的应用前景。有趣的是G1和硼酸盐形成的复合物G2可以用于对HCHO污染物实现快速、高选择性和高灵敏度的检测。其检测机理是通过坎尼扎罗歧化反应诱导传感器G2分子结构内硼酸基脱去,触发“启动”Salamo型传感器荧光团。传感器G2在空气和水中能稳定存在,在检测甲醛的同时,将有毒性的甲醛进一步转化为毒性低的化合物。实验证明传感器G2可以用于冷冻食品和水体中甲醛污染物分析。此部分的研究工作也证明:设计的不对称单Salamo型荧光化学传感器可将污染物转化达到消除污染的目的,在环境修复中具有很大的应用前景。(4)首次将单激发双发射半Salamo型传感器G3用于H+的高灵敏检测,其检测范围是pH=2~11。传感器G3检测机理是基于不同pH环境下分子呈现不同的互变异构体构型,从而抑制或开启ESIPT过程,并在生理pH环境中可实现比率传感。此外,发光Salamo型萘基传感器G3分子结构中含有Cu2+离子配位的N2O2配位空腔,可实现高选择性、高灵敏度识别Cu2+离子,其检测限为2.4×10-12mol/L。同时,该传感器G3可实现对实际水样(自来水和黄河水)中Cu2+离子的检测。为提高传感器的应用便捷性,通过制备负载传感器G3的试纸,可方便、快捷和准确地应用于实际水样中Cu2+离子的检测。此外,传感器G3对于Cu2+的识别过程可以应用于防伪领域中,这将大大拓展传感器G3的应用潜力。(5)首次开发出半Salamo型荧光传感器G4用来特异性识别精氨酸(Arg)和谷胱甘肽(GSH),其中Arg使传感器的荧光增强,而GSH使传感器的荧光猝灭。传感器G4也是第一个在含水体系中可以对Arg进行荧光检测的Salamo型荧光小分子传感器。研究发现传感器G4中不同的取代基对分子识别起着重要作用。经实验及量子化学理论计算证实了传感器G4和精氨酸形成了1:1的复合物,可以用于食品及药品中Arg的测定。传感器G4在结构中存在两个潜在活性位点,可以区分GSH与Cys/Hcy,从而建立了一种生物硫醇鉴别新策略。利用三种硫醇结构上的细微差别以及传感器G4中两个特异性结合的活性位点,消除了Cys与Hcy存在时对GSH的干扰,这为3种生物硫醇的荧光区分识别提供了可能。同时该方法具有快速、简便和经济的优点,且传感器G4细胞毒性较小,可进一步拓展应用到生理环境检测。此部分研究工作也证明:设计的新型半Salamo型荧光传感器G4在灵敏性和选择性方面有着明显的优势,有望用于疾病的早期诊断。(6)合成了Salamo型荧光传感器G5,利用其结构中Schiff碱(亚胺)键的断裂和生成分别实现了对Cl O-和SCN-高灵敏和快速识别。传感器基于分子内电荷转移(ICT)作为信号机制,通过改变电子的推-拉能力,分别实现了对ClO-和SCN-的比率荧光响应。经实验验证该传感器能在实际水样(自来水和黄河水)中很好地实现对目标物ClO-和SCN-的比率检测。基于ClO-和SCN-之间的氧化还原反应,传感器G5在检测环境体系中污染离子的同时,还可以通过化学反应降解水中的污染物而不对环境产生影响。与其它类型的传感器相比,单Salamo型荧光传感器G5具有合成简便、选择性好、灵敏度高、操作简便易行、响应时间快和可重复利用等优点。
张茜[9](2016)在《鸡血—脾屏障及其淋巴细胞归巢的机制研究》文中认为脾脏是一个专门摄取血源性抗原引起免疫反应的外周淋巴器官。脾脏白髓和红髓的结构分区使其能够有效地清除循环中的衰老红细胞以及抗原物质。作为体内最大的淋巴器官,脾脏内含丰富的免疫活性细胞T、B淋巴细胞,能够直接介导细胞免疫和体液免疫应答,共同调节机体在抗细菌和抗病毒感染中起防御作用。禽类脾脏结构与免疫细胞的组成具有一定的特殊性,有别于哺乳类,但与爬行类脾脏结构相似,主要表现为:禽类脾脏缺乏边缘区;白髓中动脉周围淋巴鞘(PALS)面积减少,增加了椭球周围淋巴鞘(PELS ),并且PALS主要分布T淋巴细胞,而PELS主要为B淋巴细胞分布区域。虽然哺乳动物脾脏的免疫形态与功能研究已有阐述,但关于禽类脾脏详细的免疫功能分区及其免疫学意义尚待揭示。目前为止,关于血-脾屏障的报道仅限于哺乳类和爬行类。血-脾屏障是免疫屏障的新概念,脾脏免疫功能的维持与血-脾屏障结构的完善密切相关。由于禽类缺乏边缘区结构,禽类脾脏是否具有血-脾屏障结构且血-脾屏障的细胞组成如何?爬行类脾脏中有关于高内皮毛细血管的报道,而高内皮是淋巴细胞归巢发生的结构基础。与哺乳类不同,禽类脾脏组织是否具有高内皮毛细血管并发生淋巴细胞归巢,其机理如何?针对上述问题,本文首先对鸡血-脾屏障结构进行研究,确立了血-脾屏障在鸡脾脏中的分布位置、细胞组成以及免疫屏障功能,并对不同日龄鸡脾脏中的屏障结构的胚后发育进一步观察,通过对鞘毛细血管内皮细胞的研究发现脾脏中淋巴细胞归巢的发生,进而从不同角度揭示鸡血-脾屏障及其高内皮的立体构筑和细胞学特性;进一步在分子水平阐述鸡脾脏中淋巴细胞归巢的分子基础和内在机制。研究结果将从细胞和分子水平上阐明鸡脾脏的免疫机制以及免疫学特性,丰富比较免疫学内容,为禽类传染性疾病的发病机制和治疗提供科学依据。试验Ⅰ鸡血-脾屏障的发现与结构组成应用光镜和透射电镜技术,结合翼静脉注射碳粒悬液和细胞化学方法确立鸡血-脾屏障的位置及屏障细胞组成。结果显示,鸡脾脏白髓包括动脉周围淋巴鞘(PALS)、椭球周围淋巴鞘(PELS)和脾小体,缺乏边缘区。鞘毛细血管末端直接与脾窦相连,鸡脾脏循环模式为闭合式循环。注射印度墨汁30min、1h、6h、12h、24h、2d、3d、5d、7d,发现PELS内椭球周围有明显的碳粒分布,而红髓和脾小体没有碳粒出现。2d内碳粒集中分布于椭球周围。随着时间的迁移,到达7d碳粒逐渐扩散至PELS、PALS和脾小体,提示鸡血-脾屏障在对抗外源碳粒的初期主要起到机械屏障作用,能够将碳粒抵挡在椭球结构和PELS,随着时间的迁移,脾脏的生物屏障发挥重要作用。碳粒被逐渐吞噬并且迁移至PALS和脾小体,为脾脏发挥特异性免疫起到重要的信息传递。细胞化学染色显示,网状纤维在椭球结构呈同心圆状分布,构成血-脾屏障的支架。酸性磷酸酶(ACP )在椭球相关细胞(EAC )、网状细胞和巨噬细胞呈阳性反应。主要组织相容性复合体MLCH在EAC上为免疫组化阳性反应。综上可见,鸡血-脾屏障位于脾脏椭球和PELS,血-脾屏障是动、静脉之间的网状组织结构,主要由血管内皮细胞、支持细胞、椭球相关细胞、网状纤维、网状细胞和巨噬细胞等构成。试验Ⅱ不同日龄鸡血-脾屏障的胚后发育研究脾脏是鸡体内最大的外周淋巴器官,是免疫活性细胞增殖、定居以及对抗原刺激发生免疫应答的重要场所。本实验通过对出壳后不同日龄鸡翼静脉注射墨汁,观察血-脾屏障在出壳后1、7、14、21、35和60日龄的碳粒阻滞位置;通过CD3和Bu-1标记T、B淋巴细胞,MHCⅡ标记抗原递呈细胞,研究其在不同日龄鸡脾脏的分布变化;从基因水平上研究免疫相关基因TLRs ( TLR2和TLR4 )和细胞因子(IL-2、IFN-γ和TNF-α)在不同日龄鸡脾脏的表达变化。结果显示,出壳后1日龄鸡血-脾屏障初步形成,但红髓仍可见未被阻挡的碳粒。随着日龄增加,14日龄至成年,屏障作用逐渐完善,碳粒被血-脾屏障阻挡在椭球和PELS区域。CD3+ T淋巴细胞主要分布于PALS和红髓,随着日龄的增长,PALS和红髓T淋巴细胞数量逐渐增加。Bu-1+B淋巴细胞分布于PELS和脾小体,随着日龄的增长,PELS的B淋巴细胞数量逐渐增加。MHCⅠI+细胞主要分布于脾脏椭球周围和红髓,并且自出壳后1日龄至成年增长趋势不显着。基因水平上,1日龄至60日龄鸡脾脏TLR2、TLR4、IL-2、IFN-y和TNF-αmRNA在出壳初期表达较高,两周后随日龄增长逐渐降低趋于稳定。由以上结果可见,鸡血-脾屏障结构随着日龄的增长逐渐发育完善。试验Ⅲ鸡脾脏椭球高内皮的细微结构及归巢地址素的表达鸡脾脏结构有着不同于哺乳类脾脏的特殊性,其椭球鞘毛细血管有着禽类特有的高内皮细胞。本文应用光镜和电镜技术观察鸡脾脏椭球结构内鞘毛细血管的内皮结构特征,通过免疫组织化学方法探究淋巴细胞归巢相关的血管细胞粘附分子VCAM-1和黏膜血管粘附分子MADCAM-1在鸡脾脏鞘毛细血管上的表达分布。结果表明,鸡脾脏内的鞘毛细血管内皮细胞呈立方状,电镜下可见淋巴细胞出现在椭球中,位于内皮细胞和血管通道附近。其中,鞘毛细血管的基底膜不连续,并有血管通道延伸至椭球内部,淋巴细胞位于延伸的血管通道处。VCAM-1和MADCAM-1在鞘毛细血管上为阳性,进一步证实了鞘毛细血管内皮细胞是鸡脾脏淋巴细胞归巢发生的场所,为深入研究鸡脾脏淋巴细胞归巢的分子机制提供依据。试验Ⅳ脾脏淋巴细胞归巢的比较研究在脾脏的进化过程中,禽类与爬行类脾脏结构类似,缺乏边缘区,脾脏白髓由动脉周围淋巴鞘(PALS )和椭球周围淋巴鞘(PELS )组成,唯一不同的是生发中心在禽类中开始形成,而爬行类脾脏没有生发中心的出现。中华鳖属于爬行纲龟鳖目,由于中华鳖脾脏的椭球内血管为高内皮血管与鸡脾脏高内皮相似,相当于哺乳类淋巴结的高内皮后微静脉,也是研究脾脏中淋巴细胞归巢的重要模型。本实验应用光镜和透射电镜技术观察中华鳖与鸡脾脏的形态结构特征。结果表明,中华鳖脾脏的鞘毛细血管与鸡脾脏类似,血管内皮为立方状,类似于高内皮后微静脉血管。脾脏椭球结构有淋巴细胞出现,并且椭球毛细血管含有促进淋巴细胞从血液迁移到脾脏白髓的血管微通道。淋巴细胞通过鞘毛细血管微通道迁移到脾脏白髓的过程包括(1 )淋巴细胞通过血管内皮细胞形成的血管微通道,穿过鞘毛细血管基底膜;(2)在支持细胞和椭球相关细胞(EAC)及其细胞突起的相互作用下,淋巴细胞迁移进入椭球结构;(3)淋巴细胞在椭球结构通过血管微通道迁移至PELS。研究结果描绘了淋巴细胞在脾脏由血液迁移至脾脏椭球的形态学证据,同时为禽类和爬行类动物脾脏淋巴细胞归巢的机制研究提供了细胞学基础。试验V LPS炎症刺激下鸡脾脏淋巴细胞归巢的机制研究(Ⅰ)整合素连接激酶的原核表达与多抗制备整合素连接激酶(ILK)是一种苏氨酸/丝氨酸的蛋白激酶,是整合素胞外区与胞内区信号传导以及细胞信号通路的重要枢纽。为获得鸡ILK多克隆抗体,用以研究整合素相关归巢因子在鸡脾脏的信号通路。本实验以ILK编码区基因序列为模板,加入酶切位点设计引物,扩增ILK抗原区域,将产物经限制性内切酶KpnI和XhoI的作用后与原核表达载体pET-30(a)+连接,构建pET-30(a)+-ILK重组质粒。通过优化表达条件,使目的蛋白在BL21 (DE3)中表达。结果显示,重组蛋白以包涵体形式存在,分子量约为27kD。重组蛋白通过Ni2+亲和层析柱纯化后加佐剂免疫兔子制备多抗,四免后采血分离血清即为抗血清,再对抗血清进行IgG分离纯化。通过间接Elisa测得抗血清效价为1:32000以上,Western blot检测抗体特异性较好,能够用于下一节鸡脾脏淋巴细胞归巢的蛋白实验。(Ⅱ) LPS炎症刺激下鸡脾脏淋巴细胞归巢的机制研究本实验通过腹腔注射脂多糖(LPS)制造炎症模型,体外荧光标记淋巴细胞示踪淋巴细胞在鸡脾脏不同时间的归巢动态。免疫组化研究脾脏T、B淋巴细胞在LPS处理下的归巢分布变化。荧光定量PCR和蛋白免疫印迹Western blot研究鸡脾脏归巢相关粘附分子在LPS处理下的基因蛋白表达变化。结果显示,CFSE标记的淋巴细胞通过鞘毛细血管首先归巢至鸡脾脏白髓椭球,随着时间推移,逐渐迁移至红髓区域。CD3、Bu-1免疫组化显示LPS处理下,白髓椭球周围淋巴鞘(PELS) B淋巴细胞减少,红髓B淋巴细胞增多但T淋巴细胞减少。电镜观察发现,LPS刺激下血液中的淋巴细胞跨高内皮细胞迁移至脾脏椭球结构。荧光定量PCR和免疫蛋白印迹Western blot研究显示归巢因子整合素β1及其配体血管细胞粘附分子VCAM-1在LPS刺激下基因和蛋白表达明显增加。此外,LPS的刺激上调了整合素连接激酶ILK和磷酸化AKT Ser473的基因蛋白表达。LPS影响鸡脾脏归巢因子整合素β1和血管细胞粘附分子VCAM-1的表达可能是通过整合素连接酶ILK磷酸化PKB/AKT通路的作用,从而诱导淋巴细胞在脾脏中的细胞迁移和分区变化。鸡脾脏首次研究淋巴细胞归巢将有助于补充禽类免疫学相关内容,为进一步研究淋巴细胞归巢在禽类传染性疾病的治疗方面提供重要的靶向措施。
徐小刚[10](2015)在《斑马鱼TIM家族基因鉴定及其在适应性体液免疫应答中的功能研究》文中研究说明T细胞免疫球蛋白粘蛋白(Tcell Ⅰg and mucin, TIM )是一类Ⅰ型跨膜糖蛋白,近年来因其在免疫系统中发挥重要作用而受到高度关注。本论文首次在斑马鱼中开展鱼类TIM家族分子鉴定与功能研究,重点探讨了斑马鱼TIM (DrTIM)家族两个主要分子DrTIM-1L和DrTIM-4L的免疫学特性。采用分子克隆技术在斑马鱼中成功获得了与哺乳动物TIM-1和TIM-4同源的TIM-1和TIM-4样家族分子(DrTIM-1L和DrTIM-4L),生物信息学分析结果显示,DrTIM- 1L和DrTIM-4L分子均属于I型跨膜结构蛋白,其中包括免疫球样蛋白IgV、粘连区、跨膜区和胞质区等结构。亚细胞定位分析显示,DrTIM-4L主要表达于细胞膜上,而DrTIM-1L则主要分布于细胞胞质区域,受到相应的刺激后可转移至细胞膜上。通过对斑马鱼白细胞的免疫荧光标记显示,DrTIM-4L可与MHC Ⅱ阳性细胞共标记,提示其主要分布于抗原递呈细胞(APC),而DrTIM-1则与CD4阳性细胞共标记,提示其主要分布于CD4+T细胞,经抗原刺激后,DrTIM-4L+MHCⅡ+和DrTIM-1L+CD4+T双阳性细胞比例分别得到明显上调,提示DrTIM-1L和DrTIM-4L可能在APC启动的适应性免疫应答中发挥作用。基因表达分析结果显示,经抗原刺激后,APC和T细胞表面的DrTIM-1L和DrTIM-4L表达上调,外周血等免疫组织中DrTIM-4L+MHCⅡ+和DrTIM-1L+CD4+T双阳性细胞比例显着增加。通过针对DrTIM-4L和DrTIM-1L基因的siRNA体内干扰实验,结合抗体封闭技术,发现在DrTIM-4L和DrTIM-1L表达受到干扰的情况下,T细胞增殖活化受到明显抑制,表明DrTIM-4L和DrTIM-1L参与了适应性免疫中T细胞的增殖活化;利用免疫磁珠分选技术分离APC和CD4+T细胞,并进行体外抗原递呈功能研究,进一步证实DrTIM-4L和DrTIM-1L对APC介导的T细胞增殖有调节作用,最终可影响IgM的产生以及实验鱼对致病菌(A.hydrophila )的免疫保护力。此外,我们还克隆到一种新的可溶性形式的TIM-4L分子(sDrTIM-4L),发现它在适应性免疫过程中具有抑制T细胞增殖活化的功能。研究结果为深入揭示TIM家族在调节适应性体液免疫中作用及其功能演化机制,提供了斑马鱼实验研究模型和科学依据。
二、人MAdCAM-1分子:基因、分子结构、分布与配体(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人MAdCAM-1分子:基因、分子结构、分布与配体(论文提纲范文)
(1)新颖含吲哚结构的法尼醇X受体激动剂的设计、合成与活性研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第一章 绪论 |
1.1 非酒精性脂肪肝概述 |
1.1.1 非酒精性脂肪肝的特点及发病机制 |
1.1.2 非酒精性脂肪肝药物治疗研究进展 |
1.2 法尼醇X受体简介 |
1.2.1 法尼醇X受体的结构和功能 |
1.2.2 法尼醇X受体与疾病的关系 |
1.3 法尼醇X受体激动剂研究进展 |
1.3.1 法尼醇X受体激动剂研究现状及临床进展 |
1.3.2 法尼醇X受体激动剂构效关系 |
1.4 研发FXR激动剂类药物所面临的问题与挑战 |
第二章 基于WAY-450 的新型FXR激动剂类药物的设计 |
2.1 WAY-450 和氮杂(?)并[4,5-B]吲哚类FXR激动剂 |
2.2 设计思路 |
2.3 WAY-450 磷酸酯前药的设计 |
2.3.1 磷酸酯前药设计可行性论证 |
2.3.2 磷酸酯化合物新颖性分析 |
2.3.3 磷酸酯前药策略的难点与风险分析 |
2.4 WAY-450中3,4-二氟苯甲酰基替代物的设计 |
2.4.1 氮杂?并[4,5-b]吲哚化合物的活性可能性论证 |
2.4.2 氮杂?并[4,5-b]吲哚化合物的新颖性分析 |
2.4.3 3,4-二氟苯甲酰基替代物策略的风险分析 |
2.5 WAY-450 中七元环开环化合物的设计 |
2.5.1 吲哚系列化合物活性可能性论证 |
2.5.2 吲哚系列化合物新颖性分析 |
2.5.3 七元环开环策略的难点与风险 |
2.6 小结 |
第三章 基于WAY-450 的新型FXR激动剂类药物的合成及活性研究 |
3.1 WAY-450 磷酸酯前药的合成尝试 |
3.1.1 磷酸酯化合物合成路线 |
3.1.2 磷酸酯合成条件探索和结果分析 |
3.2 氮杂?并[4,5-B]吲哚化合物的合成及活性评价 |
3.2.1 氮杂?并[4,5-b]吲哚化合物合成路线 |
3.2.2 氮杂?并[4,5-b]吲哚化合物合成实验 |
3.2.3 活性测试及结果 |
3.3 WAY450 中七元环开环化合物的合成及活性评价 |
3.3.1 吲哚系列化合物合成路线 |
3.3.2 吲哚系列化合物的合成 |
3.3.3 活性测试及结果 |
3.3.4 吲哚系列化合物活性结果分析与分子对接 |
3.3.5 吲哚系列化合物活性优化 |
3.4 合成实验部分 |
3.4.1 氮杂?并[4,5-b]吲哚类化合物及其中间体合成方法 |
3.4.2 吲哚系列化合物及其中间体合成方法 |
3.5 活性测试实验 |
3.5.1 分子水平活性测试-1 |
3.5.2 分子水平活性测试-2 |
3.5.3 分子水平活性测试-3 |
结论与展望 |
参考文献 |
附图 |
作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
致谢 |
(2)机器学习方法用于丙型肝炎病毒抑制剂生物活性的预测研究(论文提纲范文)
学位论文数据集 |
摘要 |
ABSTRACT |
符号和缩略词说明 |
第一章 绪论 |
1.1 丙型肝炎和丙型肝炎病毒 |
1.1.1 丙型肝炎概述 |
1.1.2 丙型肝炎病毒的起源、流行病学和多样性 |
1.1.3 丙型肝炎病毒的基因组 |
1.1.4 丙型肝炎病毒的复制周期 |
1.1.5 丙型肝炎病毒的药物靶标 |
1.1.6 丙型肝炎病毒感染的治疗 |
1.2 丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶的结构及其抑制剂 |
1.2.1 NS3/4A蛋白酶的结构和底物结合位点 |
1.2.2 NS3/4A蛋白酶的突破性抑制剂 |
1.2.3 NS3/4A蛋白酶抑制剂的研究进展 |
1.3 丙型肝炎病毒NS5A蛋白的结构及其抑制剂 |
1.3.1 NS5A蛋白的结构 |
1.3.2 NS5A蛋白抑制剂的研究进展 |
1.4 计算机辅助药物设计 |
1.4.1 计算机辅助药物设计概述 |
1.4.2 定量构效关系与机器学习 |
1.4.3 分子对接与分子动力学模拟 |
1.5 本论文的研究目的意义和研究方案 |
第二章 丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶抑制剂的定量构效关系研究 |
2.1 引言 |
2.2 材料和方法 |
2.2.1 数据集的建立 |
2.2.2 训练集与测试集的划分 |
2.2.3 分子描述符的计算 |
2.2.4 分子描述符的筛选 |
2.2.5 机器学习方法与最优参数的确定 |
2.2.6 模型的评价指标 |
2.2.7 模型的应用域 |
2.2.8 子模型的建立 |
2.3 结果与讨论 |
2.3.1 数据集相关结果 |
2.3.2 分子描述符筛选结果 |
2.3.3 多元线性回归模型结果 |
2.3.4 支持向量机模型结果 |
2.3.5 随机森林模型结果 |
2.3.6 模型的应用域结果 |
2.3.7 子模型的数据集与分子描述符筛选结果 |
2.3.8 子模型的模型结果 |
2.3.9 总模型与子模型的比较 |
2.4 小结 |
第三章 丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶抑制剂的虚拟筛选研究 |
3.1 引言 |
3.2 材料和方法 |
3.2.1 机器学习法筛选所用QSAR模型 |
3.2.2 形状与静电相似性法筛选所用模版分子构象 |
3.2.3 类药性过滤规则的修正 |
3.2.4 大型商业数据库的预处理 |
3.2.5 分子描述符的计算和QSAR模型筛选 |
3.2.6 三维构象的生成和形状与静电相似性筛选 |
3.2.7 筛选结果分子的结构聚类 |
3.2.8 候选分子的分子对接 |
3.2.9 候选分子的分子动力学模拟 |
3.2.10 候选分子的分子动力学模拟轨迹分析 |
3.3 结果与讨论 |
3.3.1 虚拟筛选结果的分子结构聚类结果 |
3.3.2 虚拟筛选结果的分子结构特征 |
3.3.3 候选分子的分子动力学模拟的RMSD分析 |
3.3.4 候选分子的结合自由能分析 |
3.3.5 候选分子与NS3/4A蛋白酶的结合模式分析 |
3.4 小结 |
第四章 丙型肝炎病毒NS5A蛋白抑制剂对野生型与突变型蛋白生物活性的三维定量构效关系研究 |
4.1 引言 |
4.2 材料和方法 |
4.2.1 野生型与突变型数据集的建立 |
4.2.2 训练集与测试集的划分 |
4.2.3 数据集中抑制剂的分子叠合 |
4.2.4 CoMFA和CoMSIA描述符的计算 |
4.2.5 偏最小二乘法建模与最优模型的确定 |
4.2.6 模型的评价指标 |
4.2.7 数据集的拓展连接指纹分析 |
4.3 结果与讨论 |
4.3.1 数据集与分子叠合相关结果 |
4.3.2 数据集中抑制剂的相似性分析 |
4.3.3 数据集GT-1a的模型结果 |
4.3.4 数据集GT-1a Y93H的模型结果 |
4.3.5 数据集GT-1a L31V的模型结果 |
4.3.6 最优模型的Tropsha参数评价 |
4.3.7 数据集GT-1a的等势图分析 |
4.3.8 数据集GT-1a Y93H的等势图分析 |
4.3.9 数据集GT-1a L31V的等势图分析 |
4.3.10 汇总三组等势图结果 |
4.3.11 ECFP指纹分析结果 |
4.4 小结 |
第五章 丙型肝炎病毒NS5A上市药物艾尔巴韦对突变Y93H和L31V的耐药性机理研究 |
5.1 引言 |
5.2 材料和方法 |
5.2.1 NS5A蛋白缺失氨基酸残基的构建 |
5.2.2 药物分子艾尔巴韦的分子对接 |
5.2.3 分子动力学模拟过程 |
5.2.4 体系的稳定性评价 |
5.2.5 MM/GBSA结合自由能的计算与分解 |
5.2.6 野生型与突变型的结合模式评价 |
5.3 结果与讨论 |
5.3.1 NS5A蛋白构建结果 |
5.3.2 分子对接结果 |
5.3.3 分子动力学模拟过程中体系RMSD变化趋势 |
5.3.4 分子动力学模拟过程中体系的MM/GBSA结合自由能结果 |
5.3.5 MM/GBSA结合自由能分解结果 |
5.3.6 模拟最后时刻的结合模式分析 |
5.3.7 结合模式汇总 |
5.4 小结 |
第六章 环氧合酶-2抑制剂的生物活性分类与分子结构聚类研究 |
6.1 引言 |
6.2 材料和方法 |
6.2.1 数据集的建立 |
6.2.2 训练集与测试集的划分 |
6.2.3 分子指纹和分子描述符的计算和筛选 |
6.2.4 机器学习方法与最优参数的确定 |
6.2.5 模型的评价指标 |
6.2.6 分子结构的聚类 |
6.3 结果与讨论 |
6.3.1 数据集相关结果与化学空间分布 |
6.3.2 分子描述符筛选结果 |
6.3.3 支持向量机模型结果 |
6.3.4 随机森林模型结果 |
6.3.5 诱饵分子集与外部测试集预测结果 |
6.3.6 抑制剂的结构聚类与高、低活性结构片段分析 |
6.3.7 MACCS指纹的信息增益分析 |
6.3.8 ECFP4指纹的信息增益分析 |
6.3.9 CORINA分子描述符分析 |
6.4 小结 |
第七章 总结与展望 |
7.1 论文总结 |
7.2 论文创新点 |
7.3 展望 |
参考文献 |
致谢 |
研究成果及发表的学术论文 |
作者简介 |
导师简介 |
答辩委员会决议书 |
(3)基于虚拟筛选和深度生成模型的药物发现与优化研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第1章 绪论 |
1.1 基于虚拟筛选的药物发现 |
1.1.1 基于结构的虚拟筛选 |
1.1.2 基于配体的虚拟筛选 |
1.2 人工智能在药物发现中的应用概述 |
1.3 基于深度生成模型的分子设计及优化 |
1.3.1 基于循环神经网络-RNN 的生成模型 |
1.3.2 基于变分自编码器-VAE 的生成模型 |
1.3.3 基于生成对抗网络-GAN 的生成模型 |
1.3.4 基于流-Glow 的生成模型 |
1.4 本章小结 |
第2章 基于虚拟筛选的新型GAPDH抑制剂的发现 |
2.1 引言 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 GAPDH结构分析 |
2.2.2 基于SiteMap的结合口袋分析 |
2.2.3 基于结构的虚拟筛选 |
2.2.4 相似化合物搜索 |
2.2.5 DC-5163 分子水平实验 |
2.2.6 DC-5163 细胞水平实验 |
2.3 结果与讨论 |
2.3.1 基于虚拟筛选发现GAPDH抑制剂DC-5163 |
2.3.2 分子水平实验验证 |
2.3.3 DC-5163 结合模式及构效关系分析 |
2.3.4 DC-5163 抑制癌细胞内GAPDH酶活性和癌细胞增殖 |
2.3.5 DC-5163 诱导细胞凋亡并抑制糖酵解过程 |
2.4 小结 |
第3章 基于分子生成模型的GPCR类多靶点药物自动优化设计 |
3.1 引言 |
3.2 数据及方法 |
3.2.1 数据集 |
3.2.2 基于循环神经网络(RNN)的分子生成 |
3.2.3 多任务神经网络(MTDNN)建模和性能指标 |
3.2.4 化学合成 |
3.2.5 功能活性实验验证 |
3.2.6 PCP-诱导的小鼠高自发实验 |
3.3 结果与讨论 |
3.3.1 用于分子生成的深度生成模型-RNN |
3.3.2 建立靶向D_1/D_2/5-HT_(1A)/5-HT_(2A)受体的分子库 |
3.3.3 基于MTDNN的活性预测模型 |
3.3.4 自适应抗精神病药物设计 |
3.3.5 Hit选择和实验验证 |
3.3.6 Hit优化和体外活性测定 |
3.3.7 化合物的体内药效评价 |
3.4 小结 |
第4章 基于深度生成模型的DDR1 抑制剂优化设计 |
4.1 引言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 数据集和模型训练 |
4.2.2 分子对接 |
4.2.3 化学合成 |
4.2.4 细胞水平实验 |
4.2.5 体内药效实验 |
4.3 结果与讨论 |
4.3.1 化合物1 作为DDR1 抑制剂研究的起始优化骨架 |
4.3.2 基于深度生成模型的DDR1 骨架优化 |
4.3.3 建立靶向DDR1 的基于骨架的虚拟分子库 |
4.3.4 候选化合物的发现-基于生成分子库的筛选与优化 |
4.3.5 化合物2 的激酶选择性评价 |
4.3.6 化合物2 抑制细胞中促炎因子的表达和DDR1 自磷酸化 |
4.3.7 化合物2 的体内药效评价 |
4.4 小结 |
第5章 全文总结 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
(4)OPAHs急性毒性和芳香烃受体活性的计算模拟(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
绪论 |
1 研究背景及选题依据 |
1.1 含氧多环芳烃(OPAHs)的毒性研究现状 |
1.1.1 OPAHs来源、分布及检出 |
1.1.2 OPAHs的毒性研究现状 |
1.2 定量结构-活性关系(QSAR) |
1.2.1 QSAR概述 |
1.2.2 描述符的概述 |
1.2.3 QSAR模型的构建方法 |
1.2.4 QSAR模型的验证和应用域的表征 |
1.2.5 QSAR模型在毒性预测的应用 |
1.3 分子对接 |
1.3.1 分子对接的概述 |
1.3.2 分子对接在毒性机理预测的应用 |
1.4 研究目的、内容及技术路线 |
2 OPAHs斑马鱼胚胎急性毒性的预测 |
2.1 QSAR模型的建立 |
2.2 QSAR模型的验证 |
2.3 QSAR模型的解释 |
2.4 小结 |
3 OPAHs芳香烃受体活性的预测 |
3.1 在重组酵母中表达的人体芳香烃受体活性的预测 |
3.1.1 QSAR模型的建立 |
3.1.2 QSAR模型的验证 |
3.1.3 QSAR模型的解释 |
3.2 在小鼠肝癌细胞中表达的小鼠芳香烃受体活性的预测 |
3.2.1 QSAR模型的建立 |
3.2.2 QSAR模型的验证 |
3.2.3 QSAR模型的解释 |
3.3 小结 |
4 PAHs和 OPAHs与小鼠芳香烃受体之间的作用力 |
4.1 分子对接的方法 |
4.2 分子对接的结果分析 |
4.3 小结 |
结论 |
参考文献 |
附录 A PAHs和OPAHs的结构和性质信息表 |
攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
致谢 |
(5)基于深度学习的抗肿瘤药物作用机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第1章 绪论 |
1.1 人工智能的兴起与发展 |
1.2 人工智能在药物发现中的应用 |
1.2.1 分子表征 |
1.2.2 基于结构的虚拟筛选 |
1.2.3 基于配体的虚拟筛选 |
1.2.4 从头药物设计 |
1.2.5 药物重定向 |
1.3 人工智能助力抗肿瘤药物发现 |
1.3.1 抗肿瘤药物的研发现状 |
1.3.2 抗肿瘤药物重定向 |
1.4 本章小结及论文总体安排 |
第2章 基于深度学习的化合物激酶谱预测方法研究 |
2.1 研究背景 |
2.1.1 激酶抑制剂的研究现状 |
2.1.2 化合物激酶谱的计算预测模型 |
2.2 研究方法 |
2.2.1 数据收集和整理 |
2.2.2 多任务深度神经网络 |
2.2.3 超参数优化 |
2.2.4 聚类交叉验证 |
2.2.5 模型评价 |
2.3 结果与讨论 |
2.3.1 模型优化 |
2.3.2 模型在外部测试集上的评价 |
2.3.3 模型比较 |
2.3.4 模型的实验验证 |
2.3.5 模型应用于选择性预测 |
2.4 全激酶组多药理学作用在线应用平台Kinome X |
2.5 本章小结 |
第3章 基于深度学习的药物细胞敏感性预测方法研究 |
3.1 研究背景 |
3.1.1 基因组表征数据集 |
3.1.2 药物敏感性的计算预测模型 |
3.1.3 图神经网络简介 |
3.2 研究方法 |
3.2.1 数据收集及处理 |
3.2.2 图注意力网络 |
3.2.3 模型评价 |
3.3 结果与讨论 |
3.3.1 模型优化与表现 |
3.3.2 模型比较 |
3.3.3 模型的可解释性 |
3.4 本章小结 |
第4章 总结与展望 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
(6)β-葡萄糖苷酶对人参皂苷生物转化及其相互作用机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第1章 绪论 |
1.1 人参皂苷概述 |
1.1.1 人参皂苷的分类及结构 |
1.1.2 人参皂苷的生理活性 |
1.1.3 人参皂苷的生物转化 |
1.2 β-葡萄糖苷酶概述 |
1.2.1 β-葡萄糖苷酶的分类 |
1.2.2 β-葡萄糖苷酶的结构与催化机制 |
1.2.3 β-葡萄糖苷酶在食品工业中的应用 |
1.3 酶与底物相互作用的研究方法概述 |
1.3.1 紫外-可见分光光度法 |
1.3.2 荧光光谱法 |
1.3.3 表面等离子共振法 |
1.3.4 圆二色光谱法 |
1.3.5 生物信息学方法 |
1.4 研究意义与内容 |
1.4.1 研究目的及意义 |
1.4.2 研究内容 |
1.4.3 研究技术路线 |
第2章 β-葡萄糖苷酶全基因合成、表达纯化及生物信息学分析 |
2.1 引言 |
2.2 材料与设备 |
2.2.1 试剂与材料 |
2.2.2 仪器设备 |
2.2.3 缓冲液配制 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 目的基因合成及密码子优化 |
2.3.2 重组质粒的酶切验证 |
2.3.3 重组质粒转化感受态细胞 |
2.3.4 重组β-葡萄糖苷酶的诱导表达及纯化 |
2.3.5 重组β-葡萄糖苷酶的鉴定 |
2.3.6 β-葡萄糖苷酶的生物信息学分析方法 |
2.3.7 序列同源性比对 |
2.3.8 构建系统进化树 |
2.4 结果与分析 |
2.4.1 目的基因密码子优化及全基因合成 |
2.4.2 重组β-葡萄糖苷酶的表达、纯化及鉴定 |
2.4.3 β-葡萄糖苷酶生物信息学分析 |
2.5 本章小结 |
第3章 多光谱方法及分子模拟探究β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用模式 |
3.1 引言 |
3.2 材料与设备 |
3.2.1 试剂与材料 |
3.2.2 仪器设备 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用荧光光谱测定 |
3.3.2 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用紫外-可见光谱测定 |
3.3.3 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1的非辐射能量转移 |
3.3.4 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用同步荧光光谱测定 |
3.3.5 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用三维荧光光谱测定 |
3.3.6 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用圆二色光谱的测定 |
3.3.7 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用局域表面等离子共振法测定 |
3.3.8 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用红外光谱测定 |
3.3.9 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用动态光散射测定 |
3.3.10 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用Zeta电位测定 |
3.3.11 分子对接 |
3.3.12 分子动力学模拟 |
3.4 结果与讨论 |
3.4.1 人参皂苷Rb_1对β-葡萄糖苷酶的荧光猝灭研究 |
3.4.2 β-葡萄糖苷酶和人参皂苷Rb_1的紫外—可见光谱研究 |
3.4.3 β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1的非辐射能量传递 |
3.4.4 β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用的同步荧光光谱 |
3.4.5 β-葡萄糖苷酶-人参皂苷Rb_1体系三维荧光光谱 |
3.4.6 β-葡萄糖苷酶及其与人参皂苷Rb_1相互作用的圆二色光谱 |
3.4.7 β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1结合作用分析 |
3.4.8 β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用的红外光谱 |
3.4.9 β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用前后粒径变化 |
3.4.10 β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用前后Zeta电位变化 |
3.4.11 β-葡萄糖苷酶与人参皂苷的分子对接结果分析 |
3.4.12 β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1分子动力学模拟结果分析 |
3.5 本章小结 |
第4章 重组β-葡萄糖苷酶的酶学性质探究及其对人参皂苷Rb_1的生物转化 |
4.1 引言 |
4.2 材料与试剂 |
4.2.1 试剂与材料 |
4.2.2 仪器设备 |
4.2.3 溶液配制 |
4.3 实验方法 |
4.3.1 p NP标准曲线的制定 |
4.3.2 溶液中温度及p H对重组β-葡萄糖苷酶活力的影响 |
4.3.3 溶液中离子及化学试剂对重组β-葡萄糖苷酶活力的影响 |
4.3.4 重组β-葡萄糖苷酶催化动力学参数的测定 |
4.3.5 重组β-葡萄糖苷酶对底物的选择性研究 |
4.3.6 超高效液相色谱(UPLC)检测方法的建立 |
4.3.7 重组β-葡萄糖苷酶对人参皂苷Rb_1的转化 |
4.3.8 超高效液相色谱(UPLC)分析 |
4.3.9 三重四极杆线性离子阱串联质谱分析 |
4.4 结果与讨论 |
4.4.1 重组β-葡萄糖苷酶的纯化及酶活分析 |
4.4.2 温度及pH对重组β-葡萄糖苷酶活力的影响 |
4.4.3 重组β-葡萄糖苷酶动力学参数 |
4.4.4 重组β-葡萄糖苷酶的底物特异性分析 |
4.4.5 超高效液相色谱法检测人参皂苷 |
4.4.6 重组β-葡萄糖苷酶生物转化人参皂苷Rb_1途径解析 |
4.4.7 质谱法检测单体人参皂苷的裂解规律 |
4.5 本章小结 |
第5章 人参皂苷PPD(S,R)及PPT(S,R)与雌激素受体结合作用及构-效关系探究 |
5.1 引言 |
5.2 实验材料与设备 |
5.2.1 试剂与材料 |
5.2.2 仪器设备 |
5.2.3 实验分析软件 |
5.3 实验方法 |
5.3.1 ERα-LBD融合表达载体构建及重组蛋白的表达纯化与鉴定 |
5.3.2 基于ERα-LBD的人参皂苷荧光偏振检测方法 |
5.3.3 双荧光素酶报告基因实验 |
5.3.4 hERα-LBD与人参皂苷相互作用的计算机模拟 |
5.4 结果与分析 |
5.4.1 重组蛋白hERα-LBD的鉴定 |
5.4.2 荧光偏振法探究人参皂苷与hERα-LBD结合能力 |
5.4.3 双荧光素酶报告基因实验探究人参皂苷对ERα的转录调控作用 |
5.4.4 人参皂苷与hERα-LBD结合的结构基础 |
5.5 本章小结 |
第6章 结论与展望 |
6.1 主要结论 |
6.2 创新点 |
6.3 后续工作展望 |
参考文献 |
导师简介 |
作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
致谢 |
(7)新型自剪切型核酶twister-sister和hatchet的结构以及催化机制研究(论文提纲范文)
致谢 |
摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
1 引言 |
1.1 核酶的发现 |
1.2 自剪切型核酶研究进展 |
1.2.1 hammerhead自剪切型核酶 |
1.2.2 hairpin自剪切型核酶 |
1.2.3 HDV自剪切型核酶 |
1.2.4 VS自剪切型核酶 |
1.2.5 glmS自剪切型核酶 |
1.2.6 twister自剪切型核酶 |
1.2.7 pistol自剪切型核酶 |
1.2.8 twister-sister自剪切型核酶 |
1.2.9 hatchet自剪切型核酶 |
1.2.10 hovlinc自剪切型核酶 |
1.3 自剪切型核酶的应用 |
1.3.1 保证体外转录RNA样品3’末端均一性 |
1.3.2 哺乳动物细胞中RNA元件的表达 |
1.3.3 基因表达与调控 |
1.3.3.1 直接调控型 |
1.3.3.2 配体依赖型 |
1.3.4 基因编辑 |
1.4 课题的创新性以及研究意义 |
2 实验材料、试剂以及仪器 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 菌株 |
2.1.2 质粒 |
2.1.3 亲和层析柱和浓缩管 |
2.2 实验试剂 |
2.2.1 RNA制备 |
2.2.1.1 克隆构建 |
2.2.1.2 获取DNA模板 |
2.2.1.3 体外转录以及RNA样品纯化 |
2.2.1.4 RNA结晶样品制备 |
2.2.2 结晶条件初步筛选和优化 |
2.2.3 hatchet自剪切型核酶凝胶过滤层析 |
2.2.4 hatchet自剪切型核酶体外酶切与连接实验 |
2.3 实验仪器与设备 |
3 实验流程与方法 |
3.1 序列设计 |
3.1.1 twister-sister自剪切型核酶保守序列分析与设计 |
3.1.2 hatchet自剪切型核酶保守序列分析与设计 |
3.2 实验相关蛋白纯化 |
3.2.1 pfu DNA聚合酶 |
3.2.2 T7 RNA聚合酶 |
3.2.3 ULP1蛋白酶 |
3.2.4 U1A蛋白 |
3.3 RNA样品制备 |
3.3.1 HT-GAAA质粒构建 |
3.3.1.1 制备E.coli DH5α感受态细胞 |
3.3.1.2 PCA(Polymerase cycling assembly)获取目的片段 |
3.3.1.3 胶回收目的片段 |
3.3.1.4 单酶切处理目的片段 |
3.3.1.5 目的片段与载体连接 |
3.3.1.6 转化 |
3.3.1.7 菌落鉴定 |
3.3.2 HT-UUCG质粒构建 |
3.3.2.1 突变PCR |
3.3.2.2 胶回收线性突变质粒 |
3.3.2.3 线性突变质粒末端磷酸化 |
3.3.2.4 突变线性化质粒环化 |
3.3.2.5 环化后质粒转化 |
3.3.2.6 测序以及序列比对 |
3.3.3 获取DNA模板 |
3.3.3.1 质粒扩增法获取大量DNA模板 |
3.3.3.2 PCR扩增法获取大量DNA模板 |
3.3.4 体外转录小量测试 |
3.3.5 体外转录大量制备 |
3.3.6 转录后RNA样品纯化 |
3.3.7 RNA结晶样品制备 |
3.4 结晶条件初步筛选以及优化 |
3.4.1 结晶条件初步筛选 |
3.4.2 晶体生长条件优化 |
3.5 晶体数据收集和处理 |
3.6 相角解析以及结构解析 |
3.7 结构分析以及突变体酶切活性实验 |
3.8 hatchet自剪切型核酶凝胶过滤分析 |
3.9 hatchet自剪切型核酶连接活性实验 |
4 实验结果 |
4.1 twister-sister自剪切型核酶三级结构以及催化机制研究 |
4.1.1 结构解析所使用序列TwS1 |
4.1.2 TwS1体外酶切活性实验结果 |
4.1.3 TwS1结晶条件优化 |
4.1.4 TwS1晶体衍射数据收集情况 |
4.1.5 TwS1晶体衍射数据参数统计表 |
4.1.6 TwS1相角解析以及模型修正 |
4.1.7 twister-sister自剪切型核酶结构以及催化性质研究 |
4.1.7.1 twister-sister自剪切型核酶整体三级结构 |
4.1.7.2 twister-sister自剪切型核酶三级结构中的额外碱基配对 |
4.1.7.3 twister-sister自剪切型核酶三级结构中的远距离相互作用 |
4.1.7.4 twister-sister自剪切型核酶四通道交汇处结构特征 |
4.1.7.5 twister-sister自剪切型核酶酶切位点处构象 |
4.2 hatchet自剪切型核酶三级结构以及催化机制研究 |
4.2.1 HT-GAAA和HT-UUCG的RNA样品纯化 |
4.2.1.1 HT-GAAA转录小量测试 |
4.2.1.2 HT-UUCG转录小量测试 |
4.2.1.3 HT-GAAA以及HT-UUCG纯化后RNA样品 |
4.2.2 HT-GAAA和HT-UUCG结晶条件优化 |
4.2.3 HT-GAAA和HT-UUCG数据收集情况 |
4.2.4 HT-GAAA和HT-UUCG晶体衍射数据参数统计表 |
4.2.5 HT-GAAA和HT-UUCG相角解析以及模型修正 |
4.2.6 hatchet自剪切型核酶结构以及催化性质研究 |
4.2.6.1 hatchet自剪切型核酶的整体三级结构 |
4.2.6.2 hatchet自剪切型核酶L1与L3之间的长距离相互作用 |
4.2.6.3 hatchet自剪切型核酶高度保守碱基之间的相互作用 |
4.2.6.4 hatchet自剪切型核酶酶切位点处结构特征以及酶切前模型 |
5 讨论与展望 |
5.1 twister-sister自剪切型核酶讨论与展望 |
5.1.1 四通道与三通道twister-sister核酶三级结构对比 |
5.1.2 四通道twister-sister 核酶与twister 核酶结构对比 |
5.1.3 twister-sister自剪切型核酶展望 |
5.2 hatchet自剪切型核酶讨论与展望 |
5.2.1 HT-UUCG和HT-GAAA三级结构比对 |
5.2.2 hachet核酶3’产物结构与HDV核酶 3’产物结构对比 |
5.2.3 hatchet自剪切型核酶3’产物二聚体的作用 |
5.2.4 hatchet自剪切型核酶展望 |
参考文献 |
作者简历 |
(8)Salamo型荧光化学传感器和配合物的合成、表征及其在环境检测与抗癌活性中的应用研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
1 绪论 |
1.1 Salen及 Salamo型配合物研究进展 |
1.1.1 Salen型配合物的合成 |
1.1.2 Salen型配合物的催化性能 |
1.1.3 Salamo型配合物的发展及催化性能 |
1.2 荧光化学传感器 |
1.2.1 荧光化学传感器的分类及识别过程 |
1.2.2 Salen型荧光化学传感器 |
1.2.3 Salamo型荧光化学传感器 |
1.3 基于肿瘤微环境特点的金属有机化合物抗癌研究与应用进展 |
1.3.1 肿瘤微环境的特点 |
1.3.2 通过调节肿瘤微环境缺氧,提高肿瘤治疗效果 |
1.3.3 以过渡金属-芳烃体系为基础的金属有机化合物作为抗癌药物的研究 |
1.4 论文选题意义及主要内容 |
2 基于半Salamo型铜(Ⅱ)配合物的合成、表征及其在肿瘤微环境中消耗谷胱甘肽增强的化学动力治疗 |
2.1 引言 |
2.2 实验部分 |
2.2.1 试剂与溶剂 |
2.2.2 测试与分析仪器 |
2.2.3 半Salamo型配体HL~1的合成 |
2.2.4 同双核铜(Ⅱ)配合物的合成 |
2.2.5 铜(Ⅱ)配合物与GSH的反应 |
2.2.6 产生羟基自由基(·OH) |
2.2.7 细胞培养和细胞活力 |
2.2.8 细胞内ROS染色 |
2.2.9 实验方法 |
2.3 结果讨论 |
2.3.1 元素分析 |
2.3.2 红外光谱分析 |
2.3.3 紫外光谱分析 |
2.3.4 铜(Ⅱ)配合物的单晶结构分析 |
2.3.5 铜(Ⅱ)配合物的X-射线粉末衍射分析 |
2.3.6 铜(Ⅱ)配合物的Hirshfeld表面分析 |
2.3.7 铜(Ⅱ)配合物的荧光性质研究 |
2.3.8 pH对铜(Ⅱ)配合物稳定性的影响 |
2.3.9 配体HL~1及铜(Ⅱ)配合物的量子化学计算 |
2.4 铜(Ⅱ)配合物在细胞中的抗肿瘤活性研究 |
2.4.1 铜(Ⅱ)配合物在体外的化学动力学治疗机制 |
2.4.2 铜(Ⅱ)配合物的细胞毒性与细胞内ROS的生成 |
2.5 结论 |
3 基于半Salamo型铜(Ⅱ)配位聚合物的合成、表征及化学动力治疗应用研究 |
3.1 引言 |
3.2 实验部分 |
3.2.1 试剂与溶剂 |
3.2.2 测试与分析仪器 |
3.2.3 半Salamo型配体H2L3的合成 |
3.2.4 半Salamo型铜(Ⅱ)配位聚合物的合成 |
3.2.5 铜(Ⅱ)配位聚合物与GSH的反应 |
3.2.6 产生羟基自由基(·OH) |
3.2.7 细胞培养和细胞活力 |
3.2.8 活死细胞染色 |
3.2.9 铜(Ⅱ)聚合物产生ROS的机理及细胞内ROS荧光探针检测 |
3.3 结果讨论 |
3.3.1 元素分析 |
3.3.2 红外光谱分析 |
3.3.3 紫外光谱分析 |
3.3.4 铜(Ⅱ)配位聚合物的单晶结构分析 |
3.3.5 聚合物的X-射线粉末衍射分析 |
3.3.6 聚合物的Hirshfeld表面分析 |
3.3.7 配位聚合物的荧光性质研究 |
3.3.8 pH对配位聚合物稳定性的影响 |
3.3.9 配体H2L3及配位聚合物的量子化学计算 |
3.4 配位聚合物在细胞中的抗肿瘤活性研究 |
3.4.1 铜(Ⅱ)配位聚合物在体外的化学动力学治疗机制 |
3.4.2 铜(Ⅱ)聚合物的细胞毒性与细胞内ROS的生成 |
3.5 结论 |
4 单Salamo型荧光化学传感器的设计合成及分别对硼酸盐和甲醛比率型荧光传感性能研究 |
4.1 引言 |
4.2 实验部分 |
4.2.1 试剂与溶剂 |
4.2.2 测试与分析仪器 |
4.2.3 传感器G1的合成过程 |
4.2.4 实验测试方法 |
4.3 结果与讨论 |
4.3.1 溶剂对化学传感器G1发光性能研究 |
4.3.2 含水量对化学传感器G1发光性能的研究 |
4.3.3 紫外滴定实验 |
4.3.4 紫外-可见吸收光谱下传感器G1的抗干扰实验 |
4.3.5 化学传感器G1对B_4O_7~(2-)识别性能研究 |
4.3.6 B_4O_7~(2-)的荧光滴定 |
4.3.7 化学传感器G1对B_4O_7~(2-)离子的最低检测限 |
4.3.8 化学传感器G1对B_4O_7~(2-)离子的抗干扰实验研究 |
4.3.9 化学传感器G1荧光稳定性 |
4.3.10 化学传感器G1对B_4O_7~(2-)离子的时间响应 |
4.3.11 化学传感器G1对B_4O_7~(2-)离子结合常数的计算 |
4.3.12 传感器G1在环境监测中的应用 |
4.3.13 化学传感器G2对HCHO识别性能研究 |
4.3.14 紫外-可见吸收光谱选择性分析与竞争性实验 |
4.3.15 化学传感器G2识别HCHO的荧光光谱 |
4.3.16 化学传感器G2对HCHO的荧光滴定 |
4.3.17 化学传感器G2对HCHO的最低检测限 |
4.3.18 化学传感器G2对HCHO的竞争实验 |
4.3.19 化学传感器G2的时间稳定性 |
4.3.20 化学传感器G2对HCHO的时间响应 |
4.3.21 化学传感器G2对HCHO配位常数的计算 |
4.3.22 荧光化学传感器的pH响应 |
4.3.23 传感器在实际样品中甲醛含量检测的应用 |
4.3.24 识别机理探讨 |
4.3.25 量子化学计算 |
4.4 结论 |
5 单激发双发射半Salamo型传感器G3的合成及其对H~+和Cu~(2+)的荧光检测研究 |
5.1 引言 |
5.2 实验部分 |
5.2.1 试剂与溶剂 |
5.2.2 测试与分析仪器 |
5.2.3 传感器G3的合成过程 |
5.2.4 实验测试方法 |
5.3 结果与讨论 |
5.3.1 化学传感器G3溶剂依赖性荧光性质 |
5.3.2 化学传感器G3在二元水混合体系中的荧光性质 |
5.3.3 化学传感器G3的pH依赖性荧光性质 |
5.3.4 pH荧光滴定实验及pKa值的测定 |
5.3.5 化学传感器G3光稳定性研究 |
5.3.6 化学传感器G3对pH响应的可逆循环 |
5.3.7 化学传感器G3选择性与竞争实验 |
5.3.8 传感器G3细胞毒性 |
5.3.9 化学传感器G3对Cu~(2+)的选择性 |
5.3.10 紫外光谱分析 |
5.3.11 紫外滴定实验 |
5.3.12 Cu~(2+)的紫外抗干扰实验 |
5.3.13 荧光滴定实验 |
5.3.14 化学传感器G3对Cu~(2+)的最低检测限 |
5.3.15 化学传感器G3对Cu~(2+)的竞争实验 |
5.3.16 化学传感器G3对Cu~(2+)离子的Job曲线测定 |
5.3.17 化学传感器G3对Cu~(2+)离子的时间响应 |
5.3.18 传感器G3在实际水样中的应用检测 |
5.3.19 利用传感器G3检测实际水样中Cu~(2+)离子的浓度 |
5.3.20 传感器G3对Cu~(2+)的荧光响应用于防伪领域 |
5.3.21 识别机理探讨 |
5.3.22 量子化学计算 |
5.4 结论 |
6 半Salamo型荧光化学传感器G4的合成及其对精氨酸(Arg)和谷胱甘肽(GSH)的选择性识别性能研究 |
6.1 引言 |
6.2 实验部分 |
6.2.1 试剂与溶剂 |
6.2.2 测试与分析仪器 |
6.2.3 传感器G4的合成过程 |
6.2.4 实验测试方法 |
6.3 结果与讨论 |
6.3.1 溶剂对化学传感器G4发光性能的影响研究 |
6.3.2 含水量对化学传感器G4发光性能的影响研究 |
6.3.3 化学传感器G4 对谷胱甘肽(GSH)、精氨酸(Arg)识别性能研究 |
6.3.4 荧光滴定光谱 |
6.3.5 化学传感器G4对Arg与 GSH的最低检测限 |
6.3.6 化学传感器G4对Arg与 GSH的竞争实验 |
6.3.7 化学传感器G4对Arg、GSH的 Job曲线测定 |
6.3.8 化学传感器G4对Arg、GSH的时间荧光响应及稳定性评价 |
6.3.9 化学传感器G4与Arg、GSH的结合常数 |
6.3.10 化学传感器G4对Arg、GSH的 p H响应 |
6.3.11 细胞活性 |
6.3.12 化学传感器G4用于检测实际样品中Arg含量 |
6.3.13 识别机理探讨 |
6.3.14 量子化学计算 |
6.4 结论 |
7 单Salamo型荧光化学传感器G5的合成及其对ClO~-/SCN~-比率型荧光传感性能的研究 |
7.1 引言 |
7.2 实验部分 |
7.2.1 试剂与溶剂 |
7.2.2 测试与分析仪器 |
7.2.3 传感器G5的合成过程 |
7.2.4 实验测试方法 |
7.3 结果与讨论 |
7.3.1 溶剂对化学传感器G5发光性能研究 |
7.3.2 含水量对化学传感器G5发光性能的研究 |
7.3.3 化学传感器G5对ClO~-识别性能研究 |
7.3.4 ClO~-的荧光滴定 |
7.3.5 化学传感器G5对ClO~-离子的最低检测限 |
7.3.6 化学传感器G5对ClO~-离子的抗干扰实验研究 |
7.3.7 化学传感器G5对ClO~-离子的时间响应 |
7.3.8 化学传感器[G5-ClO~-](G6)对SCN~-识别性能研究 |
7.3.9 化学传感器G6对SCN~-的荧光滴定 |
7.3.10 化学传感器G6对SCN~-的最低检测限 |
7.3.11 化学传感器G6对SCN~-的竞争实验 |
7.3.12 化学传感器G6对SCN~-的时间响应 |
7.3.13 化学传感器G5对ClO~-与SCN~-的可逆循环响应 |
7.3.14 检测实际水样中ClO~-和SCN~- |
7.3.15 识别机理探讨 |
7.3.16 量子化学计算 |
7.4 结论 |
8 总结与展望 |
8.1 总结 |
8.2 展望 |
致谢 |
参考文献 |
攻读学位期间的研究成果 |
(9)鸡血—脾屏障及其淋巴细胞归巢的机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
缩略符号 |
前言 |
第一篇 文献综述 |
第一章 脾脏结构及血-脾屏障的研究进展 |
第一节 脾脏结构进化的研究进展 |
1 鱼类脾脏组织结构 |
2 两栖类脾脏组织结构 |
3 爬行类脾脏组织结构 |
4 禽类脾脏组织结构 |
5 哺乳类脾脏组织结构 |
第二节 禽类脾脏结构的发育研究进展 |
1 鸡脾脏组织结构的发育进展 |
2 鸡脾脏中T、B淋巴细胞发育的研究进展 |
2.1 鸡脾脏中T淋巴细胞的发育 |
2.2 鸡脾脏中B淋巴细胞的发育 |
第三节 脾脏循环模式的概述 |
1 开放式循环 |
2 闭合式循环 |
3 混合式循环 |
第四节 脾脏功能的研究进展 |
1 造血、储血和滤血功能 |
2 内分泌功能 |
3 免疫功能 |
3.1 非特异性免疫 |
3.2 特异性免疫 |
第五节 血-脾屏障的研究进展 |
1 血-脾屏障的发现与结构组成 |
2 血-脾屏障的功能 |
2.1 机械屏障作用 |
2.2 生物屏障作用 |
2.3 传递抗原信息 |
3 血-脾屏障的调节 |
参考文献 |
第二章 淋巴细胞归巢的研究进展 |
第一节 高内皮后微静脉的研究进展 |
第二节 淋巴细胞归巢的分子基础 |
1 淋巴细胞归巢受体整合素的研究进展 |
1.1 整合素的结构 |
1.2 整合素的生物学功能 |
1.3 参与淋巴细胞归巢的整合素 |
2 整合素连接激酶的研究进展 |
3 淋巴细胞归巢地址素 |
4 LPS刺激对淋巴细胞归巢的影响 |
参考文献 |
第二篇 试验研究 |
第三章 鸡-血脾屏障的发现与结构组成 |
1 材料与方法 |
1.1 实验动物 |
1.2 主要仪器和试剂 |
1.3 光镜样品的制备 |
1.4 透射电镜的制样和观察 |
1.5 网状纤维染色步骤 |
1.6 酸性磷酸酶反应步骤 |
1.7 免疫组织化学反应步骤 |
2 结果 |
2.1 鸡脾脏组织结构特征 |
2.2 鸡血-脾屏障的位置以及对外源碳粒的屏障作用 |
3 讨论 |
参考文献 |
第四章 不同日龄鸡血-脾屏障的胚后发育研究 |
1 材料与方法 |
1.1 实验动物 |
1.2 主要仪器和试剂 |
1.3 光镜样品制备 |
1.4 透射电镜的制样和观察 |
1.5 冰冻切片免疫组织化学实验步骤 |
1.6 荧光定量qPCR检测不同日龄鸡脾脏中免疫相关因子的基因表达 |
2 结果 |
2.1 不同日龄鸡血-脾屏障的胚后发育 |
2.2 不同日龄鸡脾脏胚后发育的形态学观察 |
2.3 不同日龄鸡脾脏鞘毛细血管高内皮的超微结构 |
2.4 不同日龄鸡血-脾屏障中T、B淋巴细胞和抗原递呈细胞的分布 |
2.5 不同日龄鸡脾脏内免疫相关因子的mRNA表达变化 |
3 讨论 |
参考文献 |
第五章 鸡脾脏椭球高内皮的细微结构及归巢地址素的表达 |
1 材料与方法 |
1.1 实验动物 |
1.2 主要仪器和试剂 |
1.3 光镜样品制备 |
1.4 透射电镜的制样和观察 |
1.5 免疫组织化学实验步骤 |
2 结果 |
2.1 鸡椭球高内皮的形态结构特征 |
2.2 VCAM-1在鸡脾脏血管内皮的表达 |
2.3 MADCAM-1在鸡脾脏血管内皮的表达 |
3 讨论 |
参考文献 |
第六章 脾脏淋巴细胞归巢的比较研究 |
1 材料与方法 |
1.1 实验动物 |
1.2 主要仪器和试剂 |
1.3 光镜样品的制备 |
1.4 透射电镜的制样和观察 |
2 结果 |
2.1 鸡脾脏鞘毛细血管的形态结构 |
2.2 中华鳖脾脏鞘毛细血管的形态结构 |
2.3 鞘毛细血管微通道结构特征 |
2.4 淋巴细胞迁移至脾脏椭球的超微结构 |
3 讨论 |
4 结论 |
参考文献 |
第七章 LPS炎症刺激下鸡脾脏淋巴细胞归巢的机制研究 |
第一节 整合素连接激酶的原核表达与多抗制备 |
1 材料和方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
1.3 鸡ILK原核表达载体的构建 |
1.4 ILK抗原区基因在大肠杆菌中的表达条件优化 |
1.5 蛋白的表达、纯化与复性 |
1.6 多抗的制备 |
1.7 纯化蛋白的抗原性分析 |
2 结果 |
2.1 鸡ILK基因CDS区克隆及抗原区分析 |
2.2 ILK抗原区扩增及重组质粒酶切鉴定 |
2.3 ILK抗原区的表达纯化 |
2.4 纯化蛋白的抗原性分析 |
3 讨论 |
4 结论 |
第二节 LPS炎症刺激下鸡脾脏淋巴细胞归巢的机制研究 |
1 材料与方法 |
1.1 实验动物 |
1.2 试剂与仪器 |
1.3 脾脏淋巴细胞归巢示踪方法 |
1.4 冰冻切片免疫组织化学实验步骤 |
1.5 脾脏和血清中细胞因子IL-6和TNF-a检测 |
1.6 荧光定量qPCR检测归巢因子在鸡脾脏中的基因表达 |
1.7 Western blot检测归巢相关因子的蛋白表达 |
1.8 数据处理与分析 |
2 结果 |
2.1 CFSE活细胞标记示踪鸡脾脏淋巴细胞归巢的动态 |
2.2 LPS诱导的鸡脾脏内淋巴细胞归巢的分布变化 |
2.3 LPS刺激下淋巴细胞跨高内皮细胞的迁移 |
2.4 LPS刺激下鸡脾脏T、B淋巴细胞的分布变化 |
2.5 LPS上调血液和脾脏中IL-6和TNF-α |
2.6 LPS诱导调节淋巴细胞归巢相关因子的基因表达变化 |
2.7 LPS上调整合素β1、VCAM-1、ILK和AKTps473蛋白表达 |
3 讨论 |
4 结论 |
参考文献 |
全文总结 |
创新点 |
论文发表情况 |
致谢 |
(10)斑马鱼TIM家族基因鉴定及其在适应性体液免疫应答中的功能研究(论文提纲范文)
致谢 |
摘要 |
ABSTRACT |
1 文献综述 |
1.1 TIM家族的基本概况 |
1.1.1 TIM-1 |
1.1.2 TIM-2 |
1.1.3 TIM-3 |
1.1.4 TIM-4 |
1.2 TIM分子的生物学功能 |
1.2.1 T细胞活化的共刺激功能 |
1.2.2 TIM与细胞凋亡 |
1.2.3 TIM与细胞自噬 |
1.2.4 TIM与细胞迁移 |
1.2.5 TIM与细胞耐受及移植 |
1.2.6 TIM与病毒感染 |
1.3 TIM分子相关免疫疾病 |
1.3.1 TIM与过敏性疾病 |
1.3.2 TIM与系统性红斑狼疮 |
1.3.3 TIM与艾滋病 |
1.3.4 TIM与类风湿性关节炎 |
1.3.5 TIM与脑疟 |
1.3.6 TIM与多发性硬化 |
1.4 TIM分子的可溶性形式 |
1.5 TIM分子的互作 |
1.6 TIM分子研究中存在的问题 |
2 实验研究 |
2.1 DrTIM-1L分子鉴定及其在适应性体液免疫活化中的作用 |
2.1.1 材料与方法 |
2.1.1.1 实验动物 |
2.1.1.2 主要试剂 |
2.1.2 实验方法 |
2.1.2.1 DrTIM-1分子克隆 |
2.1.2.2 DrTIM-1基因克隆和序列测定 |
2.1.2.3 3'-RACE反应 |
2.1.2.4 生物信息学结构分析 |
2.1.2.5 原核表达质粒的构建 |
2.1.2.6 DrTIM-1L重组蛋白的诱导表达 |
2.1.2.7 多克隆抗体的制备 |
2.1.2.8 抗体的纯化 |
2.1.2.9 间接ELISA法测定抗血清效价 |
2.1.2.10 Western blot分析 |
2.1.2.11 真核表达质粒的构建 |
2.1.2.12 细胞培养和转染 |
2.1.2.13 DrTIM-1L组织分布测定 |
2.1.2.14 斑马鱼淋巴细胞的分离 |
2.1.2.15 间接免疫荧光双染色分析 |
2.1.2.16 流式检测DrTIM-1L~+CD4~+细胞动态增殖 |
2.1.2.17 细胞分选、培养以及鉴定 |
2.1.2.18 DrTIM-1L的分子迁移实验 |
2.1.2.19 DrTIM-1L和DrTIM-4L的siRNA制备 |
2.1.2.20 核心质粒的构建以及慢病毒包装 |
2.1.2.21 DrTIM-1LsiRNA干扰效果评估 |
2.1.2.22 体内抗体封闭和siRNA干扰后检测T细胞的增殖活化 |
2.1.2.23 体外干扰后检测T细胞的增殖活化 |
2.1.2.24 抗体封闭对机体体液免疫的影响 |
2.1.2.25 免疫保护实验 |
2.1.2.26 统计学分析方法 |
2.1.3 结果与分析 |
2.1.3.1 DrTIM-1L基因克隆 |
2.1.3.2 DrTIM-1L基因序列分析 |
2.1.3.3 DrTIM-1L蛋白序列分析 |
2.1.3.4 DrTIM-1L染色体定位 |
2.1.3.5 DrTIM-1L基因结构特征分析 |
2.1.3.6 DrTIM-1L分子结构特征性分析 |
2.1.3.7 DrTIM-1L三维结构对比分析 |
2.1.3.8 DrTIM-1L进化树构建与分析 |
2.1.3.9 DrTIM-1L重组质粒的构建 |
2.1.3.10 DrTIM-1L蛋白表达纯化和抗体制备 |
2.1.3.11 DrTIM-1L的亚细胞定位分析 |
2.1.3.12 DrTIM-1L表达于CD4~+T细胞 |
2.1.3.13 DrTIM-1L在CD4~+T细胞内的迁移 |
2.1.3.14 DrTIM-1L的组织表达分布 |
2.1.3.15 抗原刺激后DrTIM-1L~+CD4~+细胞的变化 |
2.1.3.16 APC和T的磁珠分选与鉴定 |
2.1.3.17 pSUPER-DrTIM-1L干扰质粒的筛选 |
2.1.3.18 病毒的感染能力评估结果 |
2.1.3.19 DrTIM-1L参与CD4~+T细胞增殖的体内试验 |
2.1.3.20 DrTIM-1L促进APC介导的T细胞增殖活化的体外试验 |
2.1.3.21 DrTIM-1L参与IgM的产生 |
2.1.3.22 DrTIM-1L参与机体的免疫防御 |
2.2 DrTIM-4L分离鉴定及其对T细胞活化和体液免疫的调节作用 |
2.2.1 实验方法 |
2.2.1.1 DrTIM-4L和sDrTIM-4L基因预测 |
2.2.1.2 sDrTIM-4L原核表达质粒的构建 |
2.2.1.3 sDrTIM-4L融合蛋白的诱导表达 |
2.2.1.4 带GST标签的sDrTIM-4L融合蛋白的纯化 |
2.2.1.5 sDrTIM-4L蛋白对T细胞增殖的影响 |
2.2.1.6 DrTIM-4L蛋白表达以及免疫学功能研究 |
2.2.2 结果与分析 |
2.2.2.1 DrTIM-4L基因克隆和分析 |
2.2.2.2 DrTIM-4L蛋白结构特征 |
2.2.2.3 DrTIM-4L原核和真核表达质粒的构建 |
2.2.2.4 DrTIM-4L蛋白的诱导表达 |
2.2.2.5 DrTIM-4L多克隆抗体的制备 |
2.2.2.6 抗体的特异性检测 |
2.2.2.7 可溶性蛋白sDrTIM-4L诱导表达以及纯化 |
2.2.2.8 DrTIM-4L是一种膜蛋白分子 |
2.2.2.9 DrTIM-4L表达在抗原递细胞表面 |
2.2.2.10 DrTIM-4LsiRNA干扰体系的构建与评价 |
2.2.2.11 DrTIM-4L的组织分布 |
2.2.2.12 DrTIM-4L受抗原刺激诱导表达 |
2.2.2.13 抗原刺激后DrTIM-4L~+MHCII~+双阳性细胞的动态变化 |
2.2.2.14 DrTIM-4L活化CD4~+T细胞的体内试验 |
2.2.2.15 DrTIM-4L活化CD4~+T的体外试验 |
2.2.2.16 sDrTIM-4L蛋白对T细胞增殖的抑制作用 |
2.2.2.17 DrTIM-4L参与机体的免疫保护作用 |
2.3 DrTIM-1L和DrTIM-4L互作探究 |
2.3.1 实验方法 |
2.3.1.1 酶联免疫吸附法 |
2.3.1.2 免疫共沉淀 |
2.3.1.3 流式细胞术 |
2.3.2 实验结果 |
2.3.2.1 DrTIM-1L和DrTIM-4L具有相互结合的能力 |
2.3.2.2 磷脂酰丝氨酸可促进DrTIM-1L和DrTIM-4L结合 |
3 讨论 |
附表1 引物汇总 |
附表2 siRNA干扰引物汇总 |
本文所涉及的基因序列号以及来源 |
参考文献 |
四、人MAdCAM-1分子:基因、分子结构、分布与配体(论文参考文献)
- [1]新颖含吲哚结构的法尼醇X受体激动剂的设计、合成与活性研究[D]. 马瑶芮. 吉林大学, 2021(01)
- [2]机器学习方法用于丙型肝炎病毒抑制剂生物活性的预测研究[D]. 秦子健. 北京化工大学, 2021
- [3]基于虚拟筛选和深度生成模型的药物发现与优化研究[D]. 谭小芹. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2021(08)
- [4]OPAHs急性毒性和芳香烃受体活性的计算模拟[D]. 金玲敏. 大连理工大学, 2021(01)
- [5]基于深度学习的抗肿瘤药物作用机制研究[D]. 李叙潼. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2021(08)
- [6]β-葡萄糖苷酶对人参皂苷生物转化及其相互作用机制研究[D]. 钟姝凝. 吉林大学, 2021(01)
- [7]新型自剪切型核酶twister-sister和hatchet的结构以及催化机制研究[D]. 郑路倩. 浙江大学, 2021(01)
- [8]Salamo型荧光化学传感器和配合物的合成、表征及其在环境检测与抗癌活性中的应用研究[D]. 郭文婷. 兰州交通大学, 2020(01)
- [9]鸡血—脾屏障及其淋巴细胞归巢的机制研究[D]. 张茜. 南京农业大学, 2016(12)
- [10]斑马鱼TIM家族基因鉴定及其在适应性体液免疫应答中的功能研究[D]. 徐小刚. 浙江大学, 2015(02)