一、我国组织工程实验研究的发展方向（论文文献综述）
王成强[1]（2021）在《3D打印多孔管状支架/水凝胶/缓释氧微球复合材料修复兔激素性股骨头坏死》文中研究说明股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head ONFH）是一种临床常见的疾病,股骨头坏死一旦发生,若不给予适当的干预,病情会持续性加重,最后不得不行关节置换手术。ONFH相关机制尚未完全明了,股骨头坏死常伴随骨代谢失衡,主要表现为成骨细胞活性下降引起的骨形成减少以及破骨细胞活性增强引起的骨吸收增加,同时股骨头内脂肪组织增生,骨小梁稀疏,空泡细胞形成,进一步发展导致骨组织坏死和股骨头承重部位塌陷。这些表现都与坏死局部微循环障碍导致的缺血缺氧有密切关系,缺氧会影响内皮细胞的存活与功能,加重血管损伤与缺血,不利于血管再生,从而进入缺血缺氧坏死的恶性循环。髓芯减压和组织工程技术的联合应用延长了患者股骨头的生存率,但由于血管的重建需要很长的一段时间,植入物内部和骨坏死区域依靠分子扩散获取氧气和营养物质,较长时间内仍处于缺血缺氧状态,不利于内/外源性种子细胞存活和发挥修复作用。基于此,我们构建了一种长期缓释氧气的明胶/过氧化钙微球（gelatin/CaO2 microspheres）,另外制备一种复层管状多孔聚已内酯/纳米羟基磷灰石（PCL/nHA scaffold）支架,结合载有BMSCs的海藻酸钠/明胶水凝胶（sodium alginate/gelatin hydrogel）,三者复合成具备良好力学特性和生物活性的可降解缓释氧支架,用于修复兔激素诱导的股骨头坏死。研究分三部分完成:第一部分提取了兔的骨髓间充质干细胞,通过鉴定细胞表面特异性分子标志物鉴定了细胞纯度,再通过诱导分化验证了细胞的多向分化潜能,最后经慢病毒转染构建了稳定表达GFP的BMSCs种子细胞。第二部分首先采用乳化分散法制备了 gelatin/CaO2微球,通过检测微球的溶氧曲线,验证其释氧性能;再经体外与BMSCs共培养行活死染色和EdU增殖实验了解微球的生物相容性和生物学功能。然后采用3D打印技术制备了一种PCL/nHA多孔管状支架,通过BMSCs共培养CCK8检测支架的生物相容性。接着采用钙离子交联的方法构建了 sodium alginate/gelatin水凝胶,激光共聚焦检测水凝胶的载细胞性能。最后通过扫描电镜检测微球,支架,水凝胶的微观结构和复合支架载的细胞粘附效果。第三部分体内实验通过给予甲强龙和LPS构建兔的SONFH动物模型,髓芯减压并将复合支架和干细胞植入股骨头内,4、12周后通过micro CT和组织学检测评价ONFH的修复效果。第一部分结果显示成功提取了高纯度的BMSCs并构建了稳定表达GFP的种子细胞克隆。第二部分结果显示体外释氧微球可以持续释放氧气约4周,并具备良好的生物相容性和低生物毒性,并可以在严重缺氧条件下改善干细胞的增殖能力;微球形态均一,包被完整,支架具有的多孔结构和高贯通性,并具备细胞粘附性能。水凝胶具备良好载细胞并能增强细胞的粘附效果。第三部分结果显示;含有释氧型复合材料具有更好促进种子细胞存活和诱导新骨形成效果,移植种子细胞直接参与了骨的修复。综上所述3D打印多孔管状支架/水凝胶/缓释氧微球复合材料具备稳定的释氧性能,较非释氧材料具有更好的修复SONFH的效果,这可能和释氧材料有利于早期种子细胞的存活和增殖有关。释氧型组织工程材料将为组织工程修复ONFH提供新思路。
吴俊[2]（2021）在《软骨脱细胞细胞外基质3D生物打印支架负载髌下脂肪垫间充质干细胞修复兔软骨病损的相关研究》文中指出研究目的软骨损伤是骨关节炎发生发展过程中极其重要的一个病理过程,临床发病率高,治疗棘手,迄今尚无满意的治疗方法。本研究期望通过组织工程学的手段,将髌下脂肪垫间充质干细胞（infrapatellar fat pad adipose derived mesenchymal stem cell,IPFP-ADSC）作为种子细胞,结合软骨脱细胞细胞外基质（decellularized cartilage extracellular matrix,dCECM）制备复合水凝胶生物墨水,利用3D生物打印的优势,实现IPFP-ADSC在支架内的均匀负载,构建具有体外成软骨分化、体内软骨缺损修复能力的活细胞生物材料,为构建组织工程化软骨修复材料并向临床转化应用提供参考。方法及结果第一部分:髌下脂肪垫间充质干细胞及软骨脱细胞细胞外基质生物学特性研究研究方法:使用Ⅰ型胶原酶消化提取新西兰大白兔IPFP-ADSC和皮下脂肪间充质干细胞（subcutaneous fat adipose derived mesenchymal stem cell,SCF-ADSC）,通过对贴壁生长和三系分化（成骨、成软骨、成脂）能力以及细胞表面标记物的检测进行干性鉴定。使用CCK-8法评估增殖能力,实时荧光定量聚合酶链式反应法（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）检测软骨分化特异性基因Ⅱ型胶原（collagenⅡ,COL2A1）和性别决定区Y框蛋白9（Sry Related HMG Box-9,Sox-9）的表达水平对二者的成软骨分化能力进行比较。分别使用文献报道的和本课题组改良的方法,联合物理、化学和酶消化法,对猪关节透明软骨进行脱细胞处理,观察dCECM的三维微观结构,通过苏木素伊红（HE）染色比较残留的细胞数量、检测dCECM残留的胶原、糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）和双链DNA（double-stranded deoxyribonucleic acid,ds DNA）含量对两种方法的脱细胞效果进行比较。将IPFP-ADSC与dCECM共培养,CCK-8法和钙黄绿素/碘化丙啶染色法（Calcein AM/PI staining）评估细胞增殖能力和活力。分别将不同浓度的dCECM（0,5 mg/mL,10 mg/mL和20mg/mL）作用于IPFP-ADSC,进行体外成软骨诱导分化,使用免疫荧光染色法（immunofluorescent staining,IF）评估Ⅱ型胶原（collagenⅡ,COL-2）,蛋白聚糖（aggrecan,ACAN）的表达情况,RT-PCR检测COL2A1和Sox-9基因表达水平,评价dCECM促IPFP-ADSC成软骨分化的生物学作用。结果:酶消化法能成功提取IPFP-ADSC和SCF-ADSC,二者均符合国际干细胞治疗学会（International Society for Stem Cell Therapy）提出的干细胞标准,具备贴壁生长,成骨、成软骨、成脂三系分化潜能,高表达CD73、CD90和CD105（>99%）,低表达CD34、CD45和HLA-DR（<1%）。相比SCF-ADSC而言,IPFP-ADSC体外增殖能力、成软骨分化能力更强,COL2A1和Sox-9基因表达水平更高（P<0.05）。两种脱细胞方法均能充分地去除软骨细胞,HE染色未见明显细胞核残留,残留ds DNA<5%。改良的脱细胞方法增加了对细胞物理破壁的次数,减少了胰酶的使用,dCECM胶原成分得以更多保留（74%vs 59.5%,P<0.05）。dCECM与IPFP-ADSC共培养,细胞生长状态良好、无脱壁现象,共培养7天时细胞活力大于90%（P>0.05）。体外诱导下,dCECM表现出促进IPFP-ADSC成软骨分化的作用,COL-2、ACAN蛋白表达量和COL2A1、Sox-9基因表达水平随着浓度的增加而提高（P<0.05）。第二部分:负载IPFP-ADSC的dCECM水凝胶支架的3D构建及其生物学特性研究第一节dCECM复合水凝胶生物墨水制备及3D打印水凝胶支架物理特性研究研究方法:制备甲基丙烯酸酐明胶/海藻酸盐（GelMA/ALG）复合水凝胶,按不同浓度添加dCECM（A:3%、B:5%、C:7%,w/v,g/mL）制备3种dCECM/GelMA/ALG复合水凝胶生物墨水,使用旋转流变仪测定黏度、弹性模量,使用Calcein AM/PI染色评估不同时间点复合水凝胶生物墨水中IPFP-ADSC细胞的活力。利用捷诺飞Regenovo3D Bio-Architect?3D生物打印系统进行打印,探索打印条件,构建水凝胶生物支架,并进一步评估水凝胶支架的机械性能、孔隙率、溶胀率、体外降解速度等物理特性。结果:三种dCECM/GelMA/ALG复合水凝胶墨水均呈现出凝胶样外观和可逆的凝胶-溶胶转变温敏特性。随着剪切速率增加黏度逐渐下降,呈现典型的“剪切变稀”现象和。三种水凝胶均有清晰的成胶点温度:A、B墨水在32～33℃,C墨水在27～29℃。72 h时,三组（非固化）生物墨水内细胞活力均>80%,C组细胞活力最差（P<0.05）,A、B组间无显着差别。通过调整打印参数,三种生物墨水均能成功实施3D生物打印。A组（dCECM浓度3%）支架机械性能、孔隙率、溶胀率较高,但体外降解速度最快,C组（dCECM浓度7%）机械性能、孔隙率、溶胀率较差,但体外降解速度最慢。第二节3D生物打印负载IPFP-ADSC组织工程支架体外成软骨分化生物学特性研究研究方法:基于第一节的结果,本节生物墨水中添加5%的dCECM进一步负载IPFP-ADSC构建活细胞3D生物打印支架,实验分为两组:IPFP-ADSC/dCECM（+）/GelMA/ALG组和IPFP-ADSC/dCECM（-）/GelMA/ALG组,IPFP-ADSC细胞密度为107/mL。利用捷诺飞Regenovo 3D Bio-Architect?系统分别构建两种活细胞支架并进行体外成软骨诱导分化。使用Calcein AM/PI染色法评估支架内的细胞活力（第3/7/14/28天）。免疫荧光染色法观察支架内COL-2和Sox-9的生成情况（第7/14/28天）。酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）测定培养液中游离COL-2、ACAN的表达水平（3/7/10/14/21/28天）。应用蛋白免疫印迹法（Western Blot）和RT-PCR法测定不同时间（第14/28天）、不同培养条件（2D和3D）下两组支架内IPFP-ADSC成软骨分化特异性蛋白（COL-2、Sox-9）和基因（COL2A1、Sox-9）的表达情况,评价dCECM和3D立体培养对IPFP-ADSC成软骨分化的影响。结果:打印后第2周,IPFP-ADSC活力均大于90%,第4周细胞活力均大于85%,各时间点差异无统计学意义（P>0.05）。COL-2和Sox-9荧光染色荧光强度随着时间推移逐渐增强,第4周时dCECM（+）组明显高于dCECM（-）组（P<0.05）。ELISA显示dCECM（-）组在第3周时培养液上清COL-2和ACAN含量与dCECM（+）组第2周水平相当;第4周时,dCECM（+）组明显高于dCECM（-）组（P<0.05）。Western Blot和RT-PCR结果显示,COL-2、Sox-9等软骨相关蛋白及基因表达水平随着诱导时间延长逐步提高:第4周时,无论是dCECM（+）组还是dCECM（-）组,3D培养条件下COL-2、Sox-9表达量均高于2D培养;无论2D还是3D培养,dCECM（+）组COL-2、Sox-9表达量均高于dCECM（-）组（P<0.05）。第三部分:3D生物打印负载IPFP-ADSC组织工程支架修复兔软骨缺损的实验研究研究方法:IPFP-ADSC及3D生物打印负载IPFP-ADSC的组织工程支架的免疫原性评估:选择新西兰大白兔作为实验动物,实验分为四组——PBS、IPFP-ADSC、dCECM/GelMA/ALG支架和IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG支架组,分别进行皮下注射或者皮下支架包埋,第2、4周时取材进行大体观察及HE染色以评价细胞和支架的免疫原性。新西兰大白兔股骨滑车软骨缺损的模型建立及修复:实验分为4组,PBS关节腔注射（A组）、IPFP-ADSC关节腔注射（B组）、dCECM/GelMA/ALG支架植入联合IPFP-ADSC关节腔注射（C组）和IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG支架植入组（D组）。新西兰大白兔股骨滑车沟制作直径4 mm,深约3 mm的全层软骨缺损,按上述分组分别对软骨缺损进行修复。第6、12周时取材,对修复效果进行大体观察评分（International Cartilage Repair Society Score）和组织学染色评分（The Modified O’Driscoll Histological Score）,评价3D生物打印负载IPFP-ADSC的组织工程支架对兔股骨滑车软骨缺损的修复效果。结果:第2/4周时,PBS及IPFP-ADSC皮下局部注射区未见异常新生组织块及粘连现象。dCECM/GelMA/ALG和IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG支架皮下包埋第二周时存在一定程度的异物炎症反应,局部包膜组织充血、粘连,可见较多炎症细胞浸润,高倍镜下中性粒细胞浸润数量比较无组间差异（3.6±0.5 vs 3.4±0.5,P>0.05）;第4周时,细胞浸润现象明显减轻,支架与周围组织无粘连充血,包膜变薄,高倍镜观察细胞浸润数量同样无组间差异（1.4±1.14 vs 1.8±0.8,P>0.05）,随时间推移,炎症反应逐渐减轻（P<0.05）。兔软骨缺损造模成功,缺损修复大体外观及组织学染色评分结果显示:软骨组织几乎没有自我修复能力;IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG支架修复效果最好,缺损部位基本完全被新生的软骨组织所覆盖,关节面光滑度高、与周围组织结合紧密,胶原、蛋白多糖沉积更多;dCECM/GelMA/ALG支架联合IPFP-ADSC关节腔注射修复效果次之,新生组织与正常软骨结合略差,关节面欠光滑,胶原、蛋白多糖沉积不均匀;单纯关节腔注射IPFP-ADSC软骨缺损处有一定程度的新生软骨,但组织松脆、结构杂乱,胶原沉积较少。大体观察与组织学染色评分组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论胶原酶消化法能够成功获取IPFP-ADSC,具备多向分化潜能,相较于SCF-ADSC,具有更强的体外增殖和成软骨分化能力,获取方便,可作为理想的软骨修复组织工程学种子细胞。改良的软骨脱细胞方法,通过加强物理破壁过程、减少胰酶的使用,同样可以充分地去除软骨细胞,三维微观结构得以保留,更多保留胶原成分。dCECM生物相容性较好,具有促进IPFP-ADSC体外增殖和成软骨分化的生物活性作用。dCECM/GelMA/ALG复合水凝胶生物墨水具备良好的生物相容性和可打印性,利用3D生物打印的优势,可以构建空间有序、均匀负载IPFP-ADSC的仿生支架,在dCECM和3D立体培养协同作用下,能更快更好地向软骨细胞分化。异体IPFP-ADSC和含异种dCECM的IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG支架免疫原性低,组织相容性好。相对于单纯的IPFP-ADSC关节腔内注射或dCECM/GelMA/ALG支架联合IPFP-ADSC关节腔注射这种细胞支架无序结合的修复材料,IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG 3D生物打印支架对大白兔软骨缺损具有更快更优的修复效果。利用3D生物打印技术的优势,联合IPFP-ADSC和dCECM构建的活细胞组织工程支架实现了将种子细胞、生物活性因子和支架材料均一、有序有机整合的目的,具有良好的体外成软骨分化能力和体内软骨缺损修复效果,是一种极具临床转化应用价值的软骨修复组织工程学治疗手段。
穆琳[3]（2021）在《脂肪来源干细胞复合光敏化水凝胶3D生物打印构建组织工程软骨的实验研究》文中认为背景小耳和无耳畸形的耳廓修复重建是整形外科医生在临床上要经常面对的难题。软骨组织再生和修复能力差,而采用自体肋软骨或人工材料制备耳廓支架存在供区并发症、取材有限、感染及免疫排斥等诸多问题。3D生物打印是在组织工程发展过程中新兴起的一种分层叠加增材制造技术,能够应用细胞和生物材料按照计算机建立的模型,构建出具有生物学活性的三维组织结构,是耳软骨重建和修复的新的希望。在基于3D生物打印技术构建组织工程软骨的研究中,打印结构中细胞存活、增殖和分化能力以及形成软骨组织的效率是重点关注的问题。脂肪来源干细胞（Adipose-derived stem cells,ADSCs）因其多向分化能力、易获得、体外扩增速度快和免疫原性低等优点被视为软骨组织工程中优秀的种子细胞。目前,有关人ADSCs应用在3D生物打印构建组织工程软骨的研究较少,尚缺乏其作为种子细胞的不同应用策略的对比研究,因此,在打印结构生物学活性、组织形成效率等关键问题上,仍缺乏有力的证据支持其对于3D生物打印制备再生软骨的适用性。目的1.用人脂肪来源干细胞复合光敏化水凝胶制备“生物墨水”,通过3D生物打印技术体外制备具有生物学活性和三维结构的软骨支架。2.提出以人脂肪来源干细胞作为种子细胞的三种不同种子细胞应用策略（1）单细胞打印（2）与软骨细胞混合打印（3）预先成软骨分化后打印,以单独打印软骨细胞为对照组,对比各种方案的优势和不足,筛选更适合应用于3D生物打印构建组织工程软骨的方案。3.将3D生物打印的细胞-水凝胶复合支架移植于裸鼠皮下体内培养,观察其形成软骨组织的能力和效率,探究此方法制备耳再造软骨支架的可行性。方法1.以人脂肪抽吸术获得的脂肪组织为来源,分离、培养和鉴定人脂肪来源干细胞,并对比观察以平面法、悬滴法和微载体法成软骨诱导培养的人脂肪来源干细胞的分化能力。2.设立实验组1（hADSCs组）、实验组2（hADSCs与软骨细胞共培养组）、实验组3（预分化hADSCs组）和对照组（软骨细胞组）,将细胞复合光敏化水凝胶甲基丙烯酰胺基明胶（Gelatin methacryloyl,GelMA）制备“生物墨水”,采用3D生物打印技术制备细胞-GelMA复合支架。各组支架生物学活性检测:活/死细胞染色检测细胞的存活率,CCK-8法检测细胞的增殖情况,实时荧光定量PCR检测细胞的成软骨基因表达。3.将各实验组和对照组打印的含细胞支架移植入裸鼠的背部皮下,8周后取材,观察支架大体形态,通过HE染色、软骨特殊染色（番红O和阿利辛蓝染色）和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察复合支架样本的软骨形成情况。结果1.成功分离提取并鉴定人脂肪来源干细胞,与平面法和悬滴法培养相对比,以微载体进行成软骨诱导分化培养的hADSCs成软骨基因表达最高,可作为3D生物打印预分化hADSCs构建组织工程软骨的细胞来源。2.GelMA水凝胶封装hADSCs以基于微挤压原理的方式进行3D生物打印,可以体外形成三维形态稳定的网格状支架结构。3.打印后一周内,hADSCs与软骨细胞共培养组的细胞存活率和细胞增殖速率最高,hADSCs组和预分化hADSCs组细胞存活率高于对照组,但细胞增殖率低。4.各组成软骨诱导分化培养14天后,hADSCs与软骨细胞共培养组成软骨基因的相对表达量高于hADSCs组,预分化hADSCs组出现软骨肥大标志基因表达。5.3D生物打印的细胞-GelMA水凝胶复合支架移植到裸鼠皮下可以形成软骨组织,hADSCs与软骨细胞共培养组形成软骨组织的效率优于hADSCs组和预分化hADSCs组,与对照组无明显差别。结论基于微挤压原理的3D生物打印的细胞-GelMA复合支架具备稳定的三维结构,移植到裸鼠皮下可以形成软骨组织。hADSCs与软骨细胞共培养组支架在体外实验中细胞存活率、细胞增殖和成软骨基因表达方面均优于对照组、hADSCs组和预分化hADSCs组,在体内实验中形成软骨组织的效率也优于hADSCs组和预分化hADSCs组,与对照组无明显差别,可进一步应用于3D生物打印组织工程软骨的制备。
李杨帆[4]（2020）在《hPDLSCs联合TGF-β3冻干海绵移植修复大鼠颅骨损伤及其机制研究》文中指出目的:由于各种意外伤害和颅骨病变所导致的颅骨缺损严重影响患者的生活,甚至会有生命危险,目前临床仍无满意的治疗方法。近年来,随着干细胞治疗的发展,为大面积颅骨缺损修复带来了希望。本实验室发现人牙周膜干细胞（h PDLSC）在TGF-β3作用下表现出更强的成骨分化性能,在此基础上应用新型类人I型胶原（RHC）/壳聚糖（CS）冻干海绵作为载体,进行h PDLSC联合TGF-β3冻干海绵移植修复大鼠颅骨临界尺寸骨缺损的实验研究,并探讨其分子机制。为骨缺损修复的干细胞治疗研究提供一种全新的搭配,给临床提供数据参考。方法:（1）通过组织块-酶消化联合法提取h PDLSCs,利用流式细胞术鉴定其表型、多向分化实验验证其干性。细胞迁移实验研究TGF-β3招募细胞的作用。通过碱性磷酸酶（ALP）活性测定及矿化实验研究TGF-β3诱导对h PDLSCs成骨分化的影响;WB检测COL I、COL II、ALP、TGF-βRI、TGF-βRII、Runx2、p-P38和P38的表达变化研究TGF-β3诱导h PDLSCs成骨分化的分子机制。（2）通过真空冷冻干燥和浸泡吸附法制备得到不同CS含量的TGF-β3/RHC/CS（TRC）冻干海绵。通过扫描电镜（SEM）、乙醇置换实验、压缩性能测试、体外降解实验、水蒸气透过实验、吸水性测试及保湿性实验对比不同CS含量制备的TRC冻干海绵的微观结构、孔隙率、力学性能、降解性、物质交换能力、吸水性及保湿性,从中优选出适宜后续实验的TRC冻干海绵。（3）SEM、MTT和Calcein-AM/PI染色检测TRC冻干海绵细胞相容性。皮下埋植实验研究TRC冻干海绵的组织相容性及降解性。CM-Dil标记法观察h PDLSCs在大鼠体内存活。通过CCK-8和ALP活性检测,研究h PDLSCs在TRC冻干海绵增殖及成骨分化性能。建立大鼠颅骨临界尺寸缺损模型进行h PDLSCs联合TGF-β3冻干海绵移植体内药效学研究。通过Mirco-CT扫描、HE&Masson染色观察颅骨缺损部位修复情况,利用免疫组织染色研究COL I、Runx2和BMP-2的表达情况。结果:（1）提取的h PDLSCs具备干细胞多向分化特性。间充质干细胞标志物CD44、CD90、CD105和CD166分别为99.7%、99.8%、98.9%和99.5%,造血干细胞标志物CD34、CD45和HLA-DR呈阴性表达。TGF-β3不影响h PDLSCs的正常生长,但促进了h PDLSCs迁移。ALP活性测试及茜素红染色结果显示:TGF-β3（20 nmol/L）诱导14天后显着提高了h PDLSCs的ALP活性（P<0.01,vs Control）;诱导21、28天后,显着促进了h PDLSCs的矿化沉积（P<0.01,vs Control）。WB测试发现TGF-β3诱导后h PDLSCs的COL I、ALP、Runx2、TGF-βRI、TGF-βRII和p-P38/t-p38蛋白表达提高。（2）1%TRC冻干海绵皱缩无立体结构,而2%、3%TRC冻干海绵能形成多孔立体结构。3%TRC冻干海绵力学性能最好,但2%TRC冻干海绵具有更好的体外降解性、吸水性、物质交换能力及保湿性。（3）TRC冻干海绵具有较好的生物相容性。TRC冻干海绵在大鼠皮下埋植90天后基本降解完全。皮下埋植21天,大鼠体内仍然可以观察到CM-Dil荧光标记的h PDLSCs细胞。TRC冻干海绵浸提液无论是进行细胞培养,还是大鼠腹腔注射均未观察到毒性反应。CCK-8实验和ALP活性检测表明h PDLSCs在TRC冻干海绵（TRC-h）上能够生长增殖及成骨分化（P<0.05,vs Control）。h PDLSC联合TGF-β3冻干海绵移植大鼠颅骨临界尺寸骨缺损部位12周,发现植入部位有新生组织填充,而模型组仅观察到一层透明薄膜。Miroc-CT结果表明TRC-h组相较于其他组,骨缺损面积显着缩小（P<0.01）。HE及Masson染色结果显示,TRC-h组骨缺损内有大量组织填充,可见大量且厚的新生骨组织生成。免疫组化观察到TRC-h组冻干海绵周围细胞的成骨相关蛋白Runx2、BMP-2和COL I表达显着高于其他各组。结论:（1）获得纯度高,具有多向分化能力的h PDLSCs。TGF-β3促进h PDLSCs迁移且不影响其增殖。TGF-β3显着促进h PDLSCs早期成骨分化活性及晚期钙沉积作用。TGF-β3通过提高h PDLSCs成骨相关蛋白的表达促进h PDLSCs成骨分化作用。（2）2%CS含量的TRC冻干海绵具有较好的理化性能。TRC冻干海绵具有良好的生物相容性、骨诱导性及合适的体内降解速率。种植在TRC冻干海绵上的h PDLSCs能够在大鼠体内存活至少21天。h PDLSCs联合TRC冻干海绵促进了大鼠颅骨临界尺寸骨缺损部位骨新生。TGF-β3可能是通过P38为靶点的信号转导诱导了h PDLSCs的成骨分化。
王毅[5]（2019）在《构建肌腱干细胞复合小牛冻干松质骨移植物的体外研究》文中进行了进一步梳理目的:改良加工小牛冻干松质骨技术,通过数字化模型精准设计股骨头骨支架及将其在自主研发的灌注生物反应器内加载肌腱干细胞诱导分化。为股骨头坏死再生提供材料基础。方法:通过对SD大鼠的股骨头MicroCT的数据进行分割重建,设计股骨头骨支架模型。采用改良的小牛冻干松质骨加工方法,将小牛新鲜松质骨数控雕刻成股骨头骨支架,并采用酶消化法进行去抗原后冻干。依据股骨头骨支架模型设计制造12轴灌注生物反应器模型,并进行3D打印实物。分离提取SD大鼠肌腱干细胞,扩增至第3代进行生物反应器内加载,并使用骨诱导培养基进行诱导成骨。结果:与小牛新鲜松质骨相比,小牛冻干松质骨脆性增加,小尺度加工易发生碎裂。先加工后去细胞冻干的改良小牛冻干松质骨加工方法成功解决了小牛冻干松质骨小尺度加工碎裂问题。加工成型的股骨头骨支架具备小于100μm的精度。自主设计的生物反应器灌注流速经过适宜肌腱干细胞的成骨和增殖流速优化可达到股骨头骨支架表面流速400-1000μm/s。能够将富肌腱干细胞的股骨头骨支架成功诱导成骨。结论:小牛冻干松质骨的数控加工技术能够生产出具有天然骨小梁各向异性结构的骨支架,将其置于灌注生物反应器内,肌腱干细胞可在其表面增殖分化。这种医学材料支架可能具有治疗股骨头坏死的潜力。
陈尚霖[6]（2019）在《影响冠心病外科治疗预后的队列研究及新型导电生物材料在心肌梗死中的作用研究》文中认为目的:通过观察OPCAB的患者队列,分析围术期他汀类药物治疗对术后早期桥血管通畅率的影响及对其他临床结局的影响。方法:本研究共纳入2009年10月至2012年9月于我院行首次单纯OPCAB的患者共582例,均通过冠脉CT获得早期桥血管通畅率。根据术前、术后是否全程连续服用他汀类药物分为两组,连续服用他汀组（Continuous statin group,CS组）398例,中断他汀组（Discontinuous statin group,DS 组）184 例。运用倾向性评分（Propensity score,PS）的统计学方法,结合倾向性评分逆概率加权（Inverse probability weighting,IPW）,对患者人口学特征、冠脉病变情况、术前血脂水平、心功能等相关因素进行逆概率加权调整,消除治疗分组偏倚,均衡队列基线情况。主要研究终点是平均术后5天的桥血管通畅率和住院死亡率。次要研究终点包括术中失血、肝、肾功能等。结果:本研究队列未发生院内死亡。经过倾向性评分逆概率加权,两组基线资料无统计学差异。PS加权前,CS组患者的出院LDL水平降至65.35mg/dL,显着低于DS组（76.57mg/dL,P=0.038）。PS 加权后,CS 组 LDL 水平降至 65.02mg/dL,显着低于DS组（78.56mg/dL,P<0.001）。CS组的患者术后早期桥血管通畅率为98.4%（桥血管通畅比为1255/1275）,DS组为98.0%（桥血管通畅比为583/595,P=0.486）。两组间桥血管通畅率无显着差异,差异在PS加权后仍无统计学意义（98.5%vs 98.0%,P=0.224）。亚组分析表明,在吸烟患者中,CS组的桥血管闭塞率显着低于DS组（CS 组为 3.6%,DS 组为 8.1%,OR0.41;95%CI0.20-0.86;P<0.05）,与非吸烟亚组相比差异显着（P=0.026）。次要终点显示,两组患者在术中失血（438.53 mL vs 480.47mL,P=0.010）,血清肌酐（1.04mg/dL vs 1.06mg/dL,P=0.331）和估测肾小球滤过率（76.28 mL/min/1.73m2 vs 76.13 mL/min/1.73m2,P=0.90）方面均无显着差异。而CS组的丙氨酸氨基转氨酶异常升高比例为8.9%,显着高于DS组的3.1%（比值比为3.06;95%置信区间,1.77-5.29,P<0.001）,表明CS组肝功能异常比DS组更为普遍。结论:在接受OPCAB的患者中,围术期连续服用他汀类药物并没有改善早期桥血管通畅率。连续服用他汀类药物在吸烟患者中可能能够降低桥血管闭塞率。围术期连续使用他汀类药物会增加肝功能异常的风险。目的:根据急性心衰患者的需要研制配套完善的、具有自主知识产权且符合临床使用要求的FW-2轴流式左心室辅助装置（Left ventricular assist device,LVAD）,对完善后的LVAD进行临床前大动物在体实验以评价其的安全性和有效性,进行临床应用标准建立。方法:1)根据前期动物实验和临床试验发现的问题,对泵出入口和外连接管道进行了优化设计和改进。2)通过七只健康成年小尾寒羊的中短期在体实验,对FW-2轴流式左心辅助装置的血液相容性和血流动力学指标进行了测试。血浆游离血红蛋白通过血浆血红蛋白测试仪（Sigma,St.Louis,MO）进行检测。到达实验终点后对各重要脏器,包括心脏、肺、肾脏、肝脏、脾、脑组织,进行系统地解剖,多点取样送病理科行组织学检查,拆分泵体并对转子、前导叶、后导叶、流入管、流出管进行检查,以评估血栓栓塞和脏器梗死情况。3)通过动物实验对配套管道系统进行优化。结果:1)改进了 FW-2泵体两端接头形状,消除截流效应。2)FW-2轴流式左心辅助装置在转速7500 rpm的条件下,输出流量控制在2.0-4.0 L/min之间。该装置的运转可有效地分流心室搏出的血液,通过调节泵的转速能够调节流量,进而调节血流动力学。在FW-2轴流式左心辅助装置12-24天实验周期内,泵体运转正常、稳定,溶血程度轻且稳定,游离血红蛋白小于1.0g/L,基本未对血液成分造成破坏,主要血清学指标和各脏器功能未见明显异常,泵体本身有少许血栓形成,全身主要脏器未见血栓及出血。病理结果显示:轴流式左心辅助装置安装后动物的心肌、肺、肝、脾、肾脏和脑组织等重要脏器未见血栓栓塞及梗死3)示范性左心室辅助装置临床应用技术完成建立。结论:1)FW-2轴流式左心室辅助装置的血液相容性能好,在大动物实验中安全、有效,可达到中短期辅助循环的目的。2)配套管道在消除截流效应的同时兼顾手术操作。3)建立了左心室辅助装置临床应用技术规范。背景心肌梗死（Myocardial infarction,MI）可导致心肌细胞的坏死,坏死心肌由成纤维细胞和胶原组织替代。而纤维组织不具有导电性,导致MI后心肌异常电信号传导,并导致心脏不同步收缩,产生室性心律失常等电机械活动异常。组织工程化生物材料已被用于治疗MI。然而,目前应用的生物材料都不具备导电性。可植入的导电生物材料支架可能具有重建梗死区及周围心肌电信号的传导以达到改善心律失常、促使心肌同步收缩和恢复心功能的潜力。这种组织工程化生物支架的生物相容性是可否植入心梗心脏并改善心肌电传导的关键因素。此外,我们还评估了该新型导电生物材料polyAMBA-Gelfoam（PAMB-G）心脏支架的导电性和有效性,支持体外心肌细胞（Cardiomyocyte,CM）的活性和功能恢复,并在大鼠心梗模型中进行外科植入治疗。方法和结果3-氨基-4-甲氧基苯甲酸（AMBA）聚合物具有独特的导电聚合物结构,但不具有生物相容性。我们将AMBA与以明胶为主要成分的明胶海绵（Gelfoam）高分子侧链结合,形成了一种新型的导电生物支架（PAMB-G）。循环伏安测试表明,PAMB-G生物支架的导电性是明胶海绵的11倍。PAMB-G生物支架对大鼠新生心肌细胞存活和生长无细胞毒性。钙瞬变分析显示,与明胶海绵相比,在PAM B-G生物支架上生长的心肌细胞具有更快的电传导速度,并可形成自发搏动且同步收缩的心肌细胞群。本研究利用明胶海绵骨架的三维孔隙结构特点,合成三维P AMB-G生物支架,并通过乳鼠心肌细胞种植进行组织工程化PAMB-G心脏支架的体外构建。64极微电极阵列（64-MEA）实验表明,PAMB-G心脏支架中的心肌细胞具有更高的场电位振幅和更快的电传导速度。将组织工程化PAMB-G心脏支架植入大鼠心脏梗死瘢痕区表面,可改善瘢痕组织中及梗死边界区的电信号传导,而单纯明胶海绵植入的心梗心脏则存在延迟的电信号传导并显着降低传导速度。程序电刺激分析表明,与明胶海绵植入组相比,植入PAMB-G支架的心梗大鼠更不容易发生心律失常。在植入PAMB-G导电生物支架4周后,心梗大鼠的左室射血分数（Left ventricular ejection fraction,LVEF）和短轴缩短率（Fraction shortening,FS）均得到改善,且种植乳鼠CM组织工程化的PAMB-G组其LVEF和FS值高于无CM种植的PAMB-G组。结论:组织工程化PAMB-G生物支架具有良好的生物相容性和导电性,能够改善心肌细胞电传导速度,改善心肌梗死后心功能,为心肌梗死的组织工程疗法提供了一个新的途径。
亚穆罕默德·阿力克[7]（2019）在《仿生多通道人工神经导管的研究》文中研究说明目的:（1）研究采用高分辨显微断层扫描（Micro-CT）扫描获取新西兰大白兔坐骨神经三维结构的最佳实验条件。（2）以兔坐骨神经为“原型”,设计可引导神经组织内部各神经束准确支配远端靶神经纤维的多通道神经导管数字化模型。以PLGA及明胶为原材料制备仿生多通道神经导管,评价多通道导管物理及生物性能。（3）将制备的仿生多通道神经导管植入新西兰大白兔坐骨神经缺损处,探讨定制化的仿生多通道组织工程神经导管对新西兰大白兔坐骨神经缺损修复的作用机制。方法:（1）取成年新西兰大白兔中段坐骨神经组织标本10mm,A、B组分别用20%、40%Lugol’s液对神经标本染色,光学显微镜及Micro-CT下分别采集两组标本在1-3天染色过程中,每1天时间点的显像变化。将显像良好的Micro-CT图像序列导入三维重建软件（Mimics）软件,通过三维重建图形实现兔坐骨神经显微三维结构的可视化。（2）取6只成年新西兰大白兔中段坐骨神经25mm标本,采用Micro-CT扫描及H&E色切片染法获得神经各束解剖学数据,对上述两种图像从神经束的数量、面积、是否存在神经束之间融合或分离现象等方面进行对比观察。依据神经组织H&E染色切片及Micro-CT图像,采用Adobe Photoshop软件设计4组具有多组通道结构神经导管数字模型。采用静电纺丝、冷冻干燥、3D打印等技术构建4种通道类型的PLGA/明胶微孔神经导管。通过观察其外貌特征,吸水膨胀实验、热收缩及力学性能测量等实验进行导管物理属性评价,细胞增殖实验及酶降解实验被用于评价导管生物学属性。（3）将仿生多通道神经导管植入新西兰大白兔中段坐骨神经10mm缺损模型。以自体神经移植及单通道（1-CANC）神经导管作为对照组,通过组织学切片观察、肌电生理检测、逆向荧光示踪等实验探讨仿生神经导管定制化的多通道结构对周围神经轴突再生的作用。结果:（1）A组神经标本在染色3天、B组标本在染色2天可经Micro-CT扫描获得较为清晰的神经显微三维结构的图像。Micro-CT图像显示新西兰大白兔坐骨神经中各神经束立体行径相对固定,生成的数字化三维模型可在任意横断面实现坐骨神经内部显微结构可视化观察。（2）新西兰大白兔坐骨神经中段具有11±1个呈不规则排列的神经束,Micro-CT扫描提示坐骨神经中段25mm各神经束之间无明显的融合或分离现象。采用Adobe Photoshop软件测量CANC导管通道和神经束匹配指数（MI）得出:3-CANC组最高（84.4%）,4-CANC组最低（51.4%）,2-CANC和3-CANC组MI分别为75.5%、77.1%。实验结果表明:制备的CANC导管具有一致的外貌、孔隙率、热收缩性能特征;吸水膨胀方面:1-CANC导管组与2-,3-,4-CANC组相比,其吸水后管腔横截面积更易于减小（p<0.05）;侧方应力实验中1-通道导管抗压强度最高,4-CANC较2-CANC组可承受更高的侧方压力（p<0.05）;抗弯曲实验显示:4-CANC抗弯强度高于3-CANC和2-CANC（p<0.05）;体外降解实验显示:与PLGA生物膜相比1-、4-CANC神经导管具有较快的降解速率;细胞增殖实验显示:附着于PLGA/明胶导管组Schwann细胞数量多余于PLGA生物膜组（p<0.05）,CANC导管组组间Schwann细胞数量无差异（p>0.05）。（3）在植入兔坐骨神经缺损模型术后第12、24周观察发现,自体神经移植组在组织学观察、电生理检测及（感觉、运动）功能恢复方面效果优于所有神经导管植入组（p<0.01）。有髓神经纤维计数结果显示:各CANC神经导管组之间有髓神经纤维数量无差异。但（2-CANC、3-CANC组）相对（1-CANC和4-CANC组）,在电镜下观察到了直径更大且髓鞘更厚的成熟神经轴突组织。类似的对比结果也出现在肌电生理检测、自噬行为及运动功能评定实验。逆行荧光示踪实验结果显示,CANC导管组中各组被荧光标记的神经元计数无统计学差异（p>0.05）,而其中被FB-NY双标记神经元比例最高的是1-CANC组（7.1%±2.4%）,4-CANC组最低（2.2%±1.2%）,结果具有显着差异（p<0.05）。结论:（1）采用20%Lugol’s液染色3天或40%Lugol’s液染色2天后的神经标本经Micro-CT扫描可获得较为清晰的显微三维图像。生成的三维重建模型可作为设计三维仿生人工神经导管重要参考依据。（2）Micro-CT扫描可准确、清晰的连续观察新西兰大白兔坐骨神经中段显微三维结构,联合3D打印模具、冷冻干燥及静电纺丝等技术可制备出简易的以兔坐骨神经解剖结构为“原型”的仿生多通道神经导管。上述方法制备的多通道仿生PLGA/明胶神经导管具有较好的生物属性和物理机械性能,可满足人工神经导管植入于动物前期实验研究要求。（3）仿生数字化人工神经的多通道结构参数对神经组织修复再生过程具有显着影响。高度仿生的神经导管多通道结构具有降低神经轴突发生错配的作用。导管通道与神经束匹配指数（MI）可能可作为研究定制化多通道神经导管仿生程度的一项评价指标。定制化的仿生神经导管多通道结构（管腔直径大小、管腔分布位置等）与修复靶神经中相应神经束解剖结构越相似,多通道神经导管MI指数越高其修复效果可能越好。
董贵荣[8]（2018）在《带仿生血管网复合肌组织支架与体外组织工程化方法研究》文中研究表明肌肉移植是有效修复大面积肌肉缺损的手段,但由于可利用的肌肉来源有限,供区损伤较大,以及异体移植供体来源和免疫排斥等问题,使其应用受到限制。随着组织工程的发展,尤其是骨骼肌组织工程在肌肉组织再生和功能重建方面的进展,为解决骨骼肌组织缺损和功能丧失等问题带来了希望。本文构建了一种带血管网酶交联水凝胶与EVOH电纺基底膜叠加组装的复合肌组织工程支架,通过体外灌流-拉伸动态培养,实现了肌细胞定向排列和向肌小管体外分化的过程,为仿生血管网的参数优化提供理论参考和实验依据。本文主要工作及成果如下:首先,以仿生设计思路为指导,通过分形模型的理论计算,提出了一种多级多尺寸的仿生血管网结构。通过分布函数计算出该血管网的分形维数为2.99,证明设计模型符合体内微小血管的功能要求,形成结构与功能相适应的生物学概念。通过CFD流体分析,将血管网模型与DAVID体外模型灌流的压力-流速曲线进行对比,结果表明流速误差小于5%,证实流体分析方法的有效性。其次,研究仿生血管网的微制造工艺,通过SLA光固化成型法和翻模制造方法,制备TG酶交联水凝胶作为基质材料的仿生血管网。研究制造仿生血管网的成型精度、降解速度和生物相容性等性能,结果证明基质材料成型精度高,可以长时间维持微流道结构,在流体和重力等因素作用下,微流道截面形状逐渐由矩形转变成更接近体内实际结构的圆形,且细胞毒性低,生物相容性好。通过CFD流体分析,确定1ml/min的流速作为体外培养的灌流参数。第三,通过多细胞共培养技术,研究了酶交联水凝胶材料的生物相容性,证实肌细胞,内皮细胞和成纤维细胞共培养时,可以在基质材料内呈现良好的增殖趋势。在仿生血管网内种植HUVEC-GFP细胞,灌流培养后,通过对细胞进行细胞形态学和增值动力学检测,研究了血管网参数对内皮化的影响。结果证明,500μm内的仿生血管网中,血管直径越小对形成内皮化越为有利,而分叉角则对细胞的生长和代谢影响不大。第四,根据体内肌肉结构,设计了血管网-基质-筋膜层的叠加式复合肌组织工程支架。通过电纺技术制备EVOH纳米纤维膜,模拟体内筋膜层,并与带血管网水凝胶组装构建复合支架。研究了纳米纤维筋膜层的制备工艺参数和支架组装工艺,叠加式支架的灌流和力学性能,为体外动态培养提供了可拉伸的肌组织工程支架模型。同时还研究了筋膜层基底膜的生物相容性和抑菌作用等生物性能,证实该支架具有良好的生物相容性,同时具有广谱抗菌作用,为多因素体外动态培养提供了有利条件。第五,设计带密封腔室的生物反应器,搭建了体外灌流-拉伸动态培养平台。该平台提供了一种密封腔室的力学拉伸试验系统,并且准确控制软组织的拉伸量。此外,该系统能够实现分别对腔室和血管网进行灌流,模拟体内血液的流动和营养供给,为细胞的增殖,延长和分化提供研究基础。第六,在体外灌流-拉伸动态培养系统上,对带血管网的肌组织工程支架进行体外动态培养。提出了一种肌组织工程体外动态培养评价方法,研究了血管网结构参数对肌细胞定向排列和分化的影响。结果证明仿生血管网能有效促进肌细胞实现定向排列和分化,并且证实了本文仿生血管网内培养液的渗透距离大约为300μm。
黄俊波[9]（2017）在《载柚皮苷骨软骨复合支架的构建及其对兔骨软骨缺损修复的实验研究》文中研究说明目的:1.构建载柚皮苷骨软骨复合支架,评价复合支架的相关性能;2.载柚皮苷骨软骨复合支架的软骨层、骨层支架分别与BMSCs共培养,评价复合支架的生物相容性;3.评价载柚皮苷骨软骨复合支架对兔膝关节骨软骨缺损的体内修复效果。方法:1.利用水包油包水相法制备载柚皮苷微球、无载柚皮苷微球;以柚皮苷作为软骨细胞增殖的缓释药物,以TGF-β1作为软骨细胞增殖的阳性对照剂,分别与Ⅰ型胶原采用混合冻干法构建软骨层支架;以凹凸棒石与Ⅰ型胶原采用溶液浇铸-粒子析出法构建骨层支架;采用3层夹心法分别构建无载柚皮苷骨软骨复合支架、载柚皮苷骨软骨复合支架、载TGF-β1骨软骨复合支架。2.肉眼及SEM观察微球和骨软骨复合支架的形貌。测定载柚皮苷微球的载药率、包封率及体外药物缓释效能;测定骨软骨复合支架中软骨层、骨层支架的孔隙率、吸水膨胀率及载柚皮苷的软骨层支架体外药物缓释效能。3.BMSCs作为种子细胞,评价载柚皮苷骨软骨复合支架的生物相容性。采用SEM观察软骨层、骨层支架上BMSCs的黏附、生长情况;利用CCK-8法检测BMSCs在软骨层、骨层支架上增殖情况。4.48只清洁级雄性日本大耳白兔随机分为A、B、C、D四组,每组12只。于兔膝关节双侧股骨髁间窝处制备直径4.5 mm、深4 mm的骨软骨缺损模型,A组为缺损（空白对照）组,B、C、D组分别于骨软骨缺损处植入无载柚皮苷骨软骨复合支架（阴性对照组）、载柚皮苷骨软骨复合支架（实验组）及载TGF-β1骨软骨复合支架（阳性对照组）。5.分别于术后3、6个月行320排动态容积CT检测、处死兔取材,分别行大体观察、Micro CT观察、HE染色、甲苯胺蓝染色和免疫组织化学染色,观察骨软骨缺损修复的效果;采用RT-PCR和Western blot方法分别检测新生软骨Ⅱ型胶原mRNA及蛋白表达水平。结果:1.肉眼观察载柚皮微球呈白色粉末状,质轻;SEM观察微球呈规则的圆球状,表面光滑,相互间没有黏连,粒径约为5-50μm。载柚皮苷微球的载药率为5.41%±0.02%、包封率为27.03%±0.07%。载柚皮苷微球的平均缓释率为14.51%;载柚皮苷的软骨层支架中药物的平均释放率为4.39%。2.肉眼观察骨软骨复合支架呈白色,圆柱状,直径4.5 mm,厚4 mm,其中软骨层支架厚2 mm,骨层支架厚2 mm。SEM显示载柚皮苷复合支架结构分层明显,软骨层支架与骨层支架黏接处紧密相连;软骨层支架呈多孔片层结构,排列无规则且相互连通,微球均匀分散于支架中,其孔隙率大于95%,吸水膨胀率大于150%;骨层支架结构致密,有大小不等的孔径相通,孔径为200-300μm。3.载柚皮苷的软骨层支架上细胞的增殖率与无载柚皮苷的软骨层支架相比明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。4.兔体内植入实验大体观察显示,术后3个月C、D组缺损范围与A、B组相比明显缩小;术后6个月C组缺损处被新生软骨所覆盖,D组新生软骨与周围正常软骨整合良好。Micro CT结果显示,术后6个月时A、B、C、D组间比较,软骨下骨密度（BMD）表达量上无统计学差异（P>0.05）。组织学染色结果显示,术后3个月时,A组和B组缺损处被少量纤维组织填充,C组和D组可见少量软骨生成;术后6个月时,C组和D组新生骨软骨组织与正常骨软骨类似,A组和B组缺损处以大量纤维组织为主。5.RT-PCR检测结果显示,C组和D组缺损处新生组织中Ⅱ型胶原mRNA表达量与A组和B组相比均上调,其差异均有统计学意义（P<0.05）,C组缺损处新生组织中II型胶原mRNA表达量与D组比较,其差异无统计学意义（P>0.05）。Western blot检测结果显示,C组和D组缺损处新生组织中II型胶原蛋白的表达量与A组和B组比较上调,其差异均有统计学意义（P<0.05）,C组缺损处新生组织中II型胶原蛋白的表达量与D组比较,其差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.构建的载柚皮苷骨软骨三层复合支架具有较高的孔隙率、吸水膨胀率,及良好的体外药物释放效能;2.BMSCs能在载柚皮苷骨软骨复合支架上增殖生长,复合支架具有良好的生物相容性;3.载柚皮苷骨软骨复合支架对兔膝关节关节骨软骨缺损有较好的修复效果,其修复效能与载TGF-β1骨软骨复合支架相比无差异。
阳运康[10]（2014）在《川芎嗪对组织工程神经修复周围神经缺损作用的实验研究》文中研究指明第一部分川芎嗪对基因修饰或缺血缺氧损伤鼠胚神经干细胞的保护作用目的：构建SD乳鼠神经干细胞体外缺血缺氧损伤及基因修饰模型；探讨TMP对神经干细胞基因修饰与缺血缺氧损伤的保护作用，以及TMP促进神经损伤修复，发挥神经保护作用的可能机制，为TMP作为神经干细胞保护剂提供细胞生物学理论依据。方法：（1）分离SD乳鼠海马神经干细胞（NSCs）进行原代培养，将二代NSCs行神经巢蛋白（Nestin）及诱导分化后的神经丝蛋白（NF-200）与胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光鉴定。取二代神经干细胞行携带EGFP基因的逆转录病毒转染并更换完全培养基，然后按TMP实验组、基因修饰对照组（GM control）、溶媒对照组（Vehicle control）分组，同时设正常对照组（Normal control）。其中TMP实验组在DMEM/F12培养基中分别加入工作浓度为50、100、200和300μg/ml的TMP，溶媒对照组在DMEM/F12培养基中加入0.1%DMSO作为溶剂对照，正常对照组为未行基因修饰的二代神经干细胞。各组均在常规条件培养箱中培养72h。通过MTT比色法、锥虫蓝染色计数及流式细胞仪检测神经干细胞活力和损伤凋亡情况，Quantitative real-time PCR和Westernblotting方法检测凋亡相关因子Bax，Bcl-2和Caspase-3的表达。另取二代NSCs分为TMP实验组（TMP group）、缺血缺氧对照组（OGDcontrol）、溶媒对照组（Vehicle control）和正常对照组（Normalcontrol）分别培养6h。其中缺血缺氧对照组、溶媒对照组和TMP实验组均采用OGD（oxygen-glucose-deprivation）法构建体外缺血缺氧损伤模型，溶媒对照组在缺血缺氧造模前即给予0.1%DMSO作为溶剂对照，TMP实验组则在造模前即刻分别加入工作浓度为50、100、200和300μg/ml的TMP，直至造模结束。正常对照组则不作任何处理在常规条件下培养6h。通过MTT比色法、锥虫蓝染色计数及流式细胞仪检测神经干细胞活力和损伤凋亡情况，Quantitative real-time PCR和Western blotting方法检测凋亡相关因子Bax，Bcl-2和Caspase-3的表达。结果：（1）与正常对照组比较，溶媒对照组和基因修饰对照组NSCs活力均显着降低，细胞死亡率及细胞凋亡率均显着增高（均P＜0.05），而抑凋亡基因Bcl-2mRNA和蛋白表达下调，促凋亡基因Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表达上调（均P＜0.05）；但基因修饰对照组与溶媒对照组组间比较上述指标无明显差异（均P＞0.05）；与基因修饰对照组比较，TMP实验组呈一定浓度依赖性，能浓度依赖地减少细胞死亡率及凋亡率，增强细胞增殖活性，且TMP可显着上调基因修饰后NSCs中Bcl-2mRNA和蛋白表达水平，下调Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表达水平，但基因修饰对照组和50、100μg/mlTMP组间无明显统计学差异（P＞0.05），200μg/mlTMP组与300μg/mlTMP组间未见明显统计学差异（P＞0.05）。（2）与正常对照组比较，溶媒对照组和缺血缺氧对照组NSCs活力均显着降低，细胞死亡率及细胞凋亡率均显着增高（均P＜0.05），而抑凋亡基因Bcl-2mRNA和蛋白表达下调，促凋亡基因Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表达上调（均P＜0.05）；但缺血缺氧对照组与溶媒对照组组间比较上述指标无明显差异（均P＞0.05）；与缺血缺氧对照组比较，TMP实验组呈一定浓度依赖性，能浓度依赖地减少细胞死亡率及凋亡率，增强细胞增殖活性，且TMP可显着上调基因修饰后NSCs中Bcl-2mRNA和蛋白表达水平，下调Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表达水平，但缺血缺氧对照组和50、100μg/mlTMP组间无明显统计学差异（P＞0.05），200μg/mlTMP组与300μg/mlTMP组间未见明显统计学差异（P＞0.05）。结论：TMP能够浓度依赖性地对基因修饰后或缺血缺氧损伤的NSCs发挥保护作用，且该作用与其调控凋亡相关因子Bcl-2、Bax及Caspase-3的表达，抑制细胞凋亡有关，这可能是TMP对周围神经系统发挥保护作用的相关机制之一。第二部分含川芎嗪培养液对组织工程化神经桥接物生物学特性的影响目的：化学法萃取Wistar大鼠脱细胞坐骨神经，构建种植基因修饰神经干细胞的组织工程化神经桥接物，探讨含TMP培养基对桥接物生物学特性的影响，为移植修复周围神经缺损提供理想的桥接体。方法：（1）12只成年健康Wistar雄性大鼠，切取双侧坐骨神经（共24条），每条长约2cm，其中20条按下列顺序进行化学处理:剥除外覆结缔组织，无菌蒸馏水清洗3次。放入3%TritonX-100中震荡24h后无菌蒸馏水清洗3次。放入4%脱氧胆酸钠中室温下震荡24h后无菌蒸馏水清洗3次。④重复23步骤，直至形成的去细胞神经呈乳白色、半透明样。HE染色、透射电镜扫描观察化学去细胞神经组织结构。⑤将化学去细胞神经放入DMEM/F12液中4℃保存备用。（2）取12条去细胞神经水化后在显微镜下用微量加样器注入10ul基因修饰神经干细胞悬液（2106/ml）后分I、II、III三组，I、II组各5条，III组2条，其中I、II组分别在常规DMEM/F12完全培养基和添加有200μg/mlTMP的完全培养基中继续培养1周；取I、II、III三组各2条切片行荧光显微镜、HE染色与免疫组化（Nestin、NF-200、GFAP）染色观察细胞分布与支架结构。（3）另取SD大鼠24只分A、B、C、D4组，每组6只，分别将4℃保存1周Wistar大鼠坐骨神经、I组组织工程化神经、II组组织工程化神经及同种异体SD大鼠坐骨神经依次包埋于皮下，7天后取出各组移植神经行HE染色光镜观察及CD4+和CD8+淋巴细胞侵润数量检测。另取SD大鼠24只分A、B、C、D4组，每组6只，分别将4℃保存1周Wistar大鼠坐骨神经、I组组织工程化神经、II组组织工程化神经及同种异体SD大鼠坐骨神经依次包埋于皮下，7天后取出各组移植神经行HE染色光镜观察及CD4+和CD8+淋巴细胞侵润数量检测。结果：去细胞神经的横切片上可见神经外膜和神经束膜形成的圆形结构,其内部为松散的胶原成分髓鞘及细胞成分基本消失。神经外膜和细胞基底膜结构均较完整。纵切片上可见较多整，齐排列的管道样结构，基本无细胞成分。注射神经干细胞后纵切片上可见神经外膜下和束膜间有较多细胞成份，分布不均。培养1周后两组均有较多增殖与分化神经细胞，基因修饰神经干细胞在去细胞桥神经中生长良好，并且有迁移成行的特性，但II组更明显，与I组差异有显着性（P＜0.05）。皮下包埋后光镜下见蓝色淋巴细胞浸润依次减少，A、B、C组间均有显着差异。C、D组间无显着差异。神经内CD4+和CD8+淋巴细胞侵润数A组最多，D组最少，A、B、C组间均有显着差异。C、D组间无显着差异。结论：异体神经化学萃取法可去除神经中的细胞和髓鞘而保留完整的神经基底膜管和纤维支架结构，并且对神经基底膜主要成分-层粘连蛋白无明显影响。种植神经干细胞并在含TMP培养基中培养后制作的组织工程化神经具有较低免疫原性及正常神经的三维结构，可能成为一种理想的组织工程化人工神经，作为修复周围神经缺损的桥接物。第三部分川芎嗪预处理组织工程化神经桥接物修复大鼠坐骨神经缺损的实验研究目的：研究川芎嗪预处理对组织工程化神经桥接物修复大鼠1.5cm坐骨神经缺损的效果。方法：分别按前述方法制作基因修饰的SD大鼠神经干细胞、脱细胞的Wistar大鼠坐骨神经、种植神经干细胞并在含川芎嗪培养基中共培养1周的组织工程化神经。将55只200-250克成年雌性SD大鼠分为A、B、C、D共4组，A、B、C组各15只，D组10只，实验侧均为右后肢坐骨神经。1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,显露坐骨神经,从梨状肌下缘0.5cm处切除神经1.5cm,分别用4种移植物桥接大鼠1.5cm坐骨神经缺损:含川芎嗪的组织工程化神经组（A组）、脱细胞异体神经组（B组）、异体神经组（C组）、自体神经组（D组）。术后A组术侧小腿三头肌内注射TMP液（16mg/kg/日），其余各组（B、C、D组）注射相同体积0.9%NS，连续注射12周至实验结束。术后2周、12周通过大体观察、神经电生理检测、肌肉湿重称重、荧光显微镜观察、辣根过氧化物酶（HRP）逆行示踪及组织学指标评价各组修复神经缺损的效果。结果：术后12周大体观察发现A、D组实验侧足趾明显散开，足趾印迹分散，恢复足爪着地行走，右后肢蹬力良好，明显优于B、C组；A组坐骨神经功能指数测定、运动神经传导速度和肌肉湿重恢复均优于B、C组（P<0.05），略差于D组（P>0.05）；荧光显微镜与免疫组化染色检测发现，NSCs能在体内存活、迁移并分化为神经元和胶质细胞，A组优于B、C组；术后12周辣根过氧化物酶（HRP）逆行示踪检测提示A组脊神经节中HRP标记的细胞数较B、C组多（P<0.05），甲苯胺蓝染色发现A组移植段再生神经纤维较多,以有髓神经纤维为主，明显优于B、C组（P<0.05）。结论：种植神经干细胞并在含川芎嗪培养液中培养1周的脱细胞异体神经构成的组织工程化神经桥接物能有效修复大鼠坐骨神经缺损，促进周围神经再生及下肢运动功能的恢复。
二、我国组织工程实验研究的发展方向（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、我国组织工程实验研究的发展方向（论文提纲范文）
（1）3D打印多孔管状支架/水凝胶/缓释氧微球复合材料修复兔激素性股骨头坏死（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 研究背景 |
| 1.1 股骨头坏死的概述和激素性股骨头坏死的发病机制 |
| 1.2 病理性缺血缺氧在股骨头坏死中的意义 |
| 1.3 股骨头坏死的临床分期和治疗现状 |
| 1.4 组织工程技术修复激素性股骨头坏死的研究进展 |
| 1.5 释氧型组织工程材料研究现状和在治疗股骨头坏死中的意义 |
| 参考文献 |
| 第一部分 兔骨髓间充质干细胞的获取和荧光蛋白标记 |
| 1.1 研究目的 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 研究结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 复合型缓释氧支架的制备和性能检测 |
| 2.1 研究目的 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 复合型缓释氧支架修复兔激素性股骨头坏死的实验研究 |
| 3.1 研究目的 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 研究的创新之处 |
| 研究的不足之处和展望 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 博士攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（2）软骨脱细胞细胞外基质3D生物打印支架负载髌下脂肪垫间充质干细胞修复兔软骨病损的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 一、 骨性关节炎及软骨损伤的治疗现状 |
| 二、 组织工程学在软骨损伤修复领域的应用 |
| 三、 论文工作的提出 |
| 第一部分 髌下脂肪垫间充质干细胞及软骨脱细胞细胞外基质生物学特性的研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 负载IPFP-ADSC的dCECM水凝胶支架的3D构建及其生物学特性的研究 |
| 第一节 dCECM复合水凝胶生物墨水制备及3D打印水凝胶支架的理化特性研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二节 3D生物打印负载IPFP-ADSC组织工程支架体外成软骨分化生物学特性研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 3D生物打印负载IPFP-ADSC组织工程支架修复兔软骨缺损的实验研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第四部分 总结与展望 |
| 一、本文工作总结 |
| 二、主要成果及创新点 |
| 三、不足之处及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 脱细胞细胞外基质生物材料在组织工程中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文及科研工作情况 |
| 致谢 |
（3）脂肪来源干细胞复合光敏化水凝胶3D生物打印构建组织工程软骨的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 脂肪干细胞的培养、鉴定和成软骨诱导分化 |
| 一、材料和试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论与小结 |
| 第二章 细胞和GelMA共混生物墨水3D生物打印支架的生物学活性分析及体外成软骨分化的研究 |
| 一、材料和试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论和小结 |
| 第三章 细胞和GelMA共混生物墨水3D生物打印支架的体内成软骨实验研究 |
| 一、材料和试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论和小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 脂肪来源间充质干细胞联合3D生物打印技术构建组织工程软骨的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词及中英文对照表 |
| 致谢 |
（4）hPDLSCs联合TGF-β3冻干海绵移植修复大鼠颅骨损伤及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.干细胞治疗在再生医学领域的研究现状及发展前景 |
| 2.干细胞治疗骨损伤的现状及发展趋势 |
| 3.牙周膜干细胞作为种子细胞的研究 |
| 4.转化生长因子3(TGF-β3)在骨修复中研究现状 |
| 5.生物支架材料研究现状 |
| 6.本课题思路及研究内容 |
| 第二章 TGF-β3 诱导h PDLSCs成骨分化作用及机制研究 |
| 1.实验试剂及仪器设备 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 第三章 TGF-β3/RHC/CS冻干海绵制备及表征 |
| 1.实验试剂及仪器设备 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 附录 :RHC对 h PDLSCs粘附和生长状态的影响研究 |
| 第四章 h PDLSCs联合TGF-β3 移植修复效果评价 |
| 1.实验试剂及仪器设备 |
| 2.实验动物 |
| 3.实验方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 1.全文总结 |
| 2.创新点 |
| 3.不足与展望 |
| 缩写、术语表 |
| 参考文献 |
| 在校期间取得的主要成果 |
| 致谢 |
（5）构建肌腱干细胞复合小牛冻干松质骨移植物的体外研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 股骨头坏死的治疗策略 |
| 1. 股骨头坏死 |
| 2. 股骨头坏死的现行治疗方案 |
| 3. 股骨头坏死干细胞及支架的治疗进展及存在问题 |
| 异种松质骨治疗骨缺损 |
| 研究目的及方案 |
| 参考文献 |
| 第一章 小牛冻干松质骨与SD大鼠骨密度分析比较 |
| 1.1 Micro CT用于骨矿物质密度分析 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 小牛冻干松质骨圆雕加工碎裂原因分析 |
| 2.1 骨再生支架设计加工进展 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 小牛冻干松质骨圆雕加工技术改良与加工精度分析 |
| 3.1 数控精雕技术 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 股骨头骨支架仿体手术研究 |
| 4.1 股骨头坏死分析技术进展 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 生物反应器设计与加工 |
| 5.1 生物反应器进展 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 富肌腱干细胞生物反应器内孵化探索 |
| 6.1 间充质干细胞治疗股骨头坏死进展 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 多尺度干细胞技术治疗股骨头坏死的进展 |
| 参考文献 |
| 硕士在读期间发表论文及科研情况 |
| 致谢 |
（6）影响冠心病外科治疗预后的队列研究及新型导电生物材料在心肌梗死中的作用研究（论文提纲范文）
| 引言 |
| 第一部分 他汀类药物在非体外循环下冠状动脉旁路移植术围术期应用效果评价的队列研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 2. 背景 |
| 3. 材料与方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 7. 参考文献 |
| 第二部分 FW-2轴流式左心室辅助装置的临床前大动物实验研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 2. 背景 |
| 3. 材料与方法 |
| 4. 结果与讨论 |
| 5. 建立示范性左心室辅助装置临床应用技术 |
| 6. 结论 |
| 7. 参考文献 |
| 第三部分 一种新型导电生物材料在改善大鼠心肌梗死后受损心肌电传导性的作用与机制研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 2. 背景 |
| 3. 材料与方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 7. 参考文献 |
| 综述 心室心肌卸负荷与心肌细胞增殖 |
| 参考文献 |
| 附录1: 英文缩略词对照表 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）仿生多通道人工神经导管的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 兔坐骨神经显微三维结构的获取与重建 |
| 1.研究内容与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验动物及主要试剂 |
| 1.3 实验分组及方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分 多通道导管的模型设计及制备及物理性能及生物相容性能检测评价 |
| 1.内容与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验动物及主要试剂 |
| 1.3 相关液体配置 |
| 1.4 实验分组与方法 |
| 1.5 检测指标 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三部分 多通道人工神经导管修复兔坐骨神经的实验研究 |
| 1.研究内容与方法 |
| 1.1 相关试剂 |
| 1.2 相关设备 |
| 1.3 实验动物及分组 |
| 1.4 观察及检测指标 |
| 1.5 统计方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（8）带仿生血管网复合肌组织支架与体外组织工程化方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 选题背景及研究意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 肌组织工程支架制备方法的研究现状 |
| 1.2.2 仿生血管网的设计与制造的研究现状 |
| 1.2.3 肌组织支架体外组织工程化方法的研究现状 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.4 研究方法和技术路线 |
| 1.4.1 研究方法 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 2 仿生血管网的设计、分维计算与流动性分析 |
| 2.1 仿生血管网设计要求 |
| 2.1.1 莫里法则 |
| 2.1.2 仿生血管网分叉角设计原则 |
| 2.1.3 仿生血管网长度设计原则 |
| 2.1.4 仿生血管网横截面设计原则 |
| 2.1.5 血管网循环结构设计原则 |
| 2.1.6 血管分支数量的确定 |
| 2.2 分形血管模型的建立与分析 |
| 2.2.1 分形血管模型建立及假设条件 |
| 2.2.2 分形血管参数计算与分析 |
| 2.3 仿生血管网结构设计 |
| 2.3.1 仿生血管网模型设计 |
| 2.3.2 仿生血管网参数设计 |
| 2.4 仿生血管网维数计算与分析 |
| 2.4.1 分形血管维数的定义 |
| 2.4.2 分形血管维数的计算 |
| 2.5 仿生血管网流体流动性分析 |
| 2.5.1 血流动力学参数与研究方法 |
| 2.5.2 仿生血管网流体仿真模型建立 |
| 2.5.3 仿生血管网流动性分析结果 |
| 2.6 小结 |
| 3 仿生血管网的制备方法与性能研究 |
| 3.1 仿生血管网制备工艺 |
| 3.1.1 支架模具制造工艺 |
| 3.1.2 基质材料交联性能研究 |
| 3.1.3 带血管网支架制造工艺 |
| 3.2 仿生血管网精度研究 |
| 3.2.1 仿生血管网成型精度研究 |
| 3.2.2 仿生血管网降解精度研究 |
| 3.3 成型后仿生血管网流动性分析 |
| 3.3.1 成型后仿生血管网模型建立 |
| 3.3.2 成型前后仿生血管网流动性对比分析 |
| 3.4 酶交联水凝胶多细胞相容性实验研究 |
| 3.4.1 细胞外基质材料的研究基础 |
| 3.4.2 实验试剂及仪器 |
| 3.4.3 支架和细胞准备 |
| 3.4.4 多细胞培养实验 |
| 3.4.5 生物相容性实验结果分析 |
| 3.5 小结 |
| 4 仿生血管网的内皮化研究 |
| 4.1 血管网外基质材料毒性实验研究 |
| 4.1.1 实验试剂及仪器 |
| 4.1.2 内皮细胞准备 |
| 4.1.3 实验过程及检测方法 |
| 4.1.4 细胞毒性实验结果分析 |
| 4.2 仿生血管网灌流能力研究 |
| 4.2.1 灌流支架设计与制备 |
| 4.2.2 灌流平台搭建 |
| 4.2.3 灌流性能实验结果分析 |
| 4.3 仿生血管网内皮化实验研究 |
| 4.3.1 实验仪器和细胞准备 |
| 4.3.2 血管网内皮化研究方法 |
| 4.3.3 血管网内皮化结果分析 |
| 4.4 小结 |
| 5 复合肌组织工程支架的制备及性能研究 |
| 5.1 复合肌组织工程支架的模型设计 |
| 5.1.1 肌肉解剖结构 |
| 5.1.2 复合肌组织工程支架模型建立 |
| 5.2 基底膜制备工艺过程及样品检测 |
| 5.2.1 电纺制备原理 |
| 5.2.2 电纺纤维材料材料配方及制备工艺 |
| 5.2.3 电纺纤维样品检测 |
| 5.3 基底膜生物相容性实验研究 |
| 5.3.1 实验设备、实验样品和细胞的准备 |
| 5.3.2 实验过程及检测方法 |
| 5.3.3 基底膜生物相容性实验结果分析 |
| 5.4 基底膜抑菌实验研究 |
| 5.4.1 细菌与试剂准备 |
| 5.4.2 实验过程及检测方法 |
| 5.4.3 基底膜抑菌实验结果分析 |
| 5.5 复合肌组织工程支架的制备 |
| 5.5.1 仿生血管网的制备 |
| 5.5.2 复合肌组织工程支架的制备与组装 |
| 5.5.3 复合肌组织工程支架粘附性实验 |
| 5.6 小结 |
| 6 复合肌组织工程支架/细胞的体外动态培养实验研究 |
| 6.1 灌流-拉伸生物反应器平台设计 |
| 6.1.1 动态拉伸原理 |
| 6.1.2 动态灌流原理 |
| 6.2 灌流-拉伸生物反应器平台搭建 |
| 6.2.1 密封腔的设计和制造 |
| 6.2.2 体外动态培养平台搭建 |
| 6.3 体外灌流-拉伸动态培养实验 |
| 6.3.1 实验试剂及仪器 |
| 6.3.2 细胞和样品准备 |
| 6.3.3 体外动态灌流-拉伸实验 |
| 6.4 体外动态培养评价方法 |
| 6.4.1 细胞形态学评价方法 |
| 6.4.2 增殖动力学评价方法 |
| 6.4.3 rt-PCR检测方法 |
| 6.5 体外动态培养实验结果 |
| 6.5.1 细胞形态学评价 |
| 6.5.2 增殖动力学评价 |
| 6.5.3 分化潜能评价 |
| 6.6 小结 |
| 7 结论和展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（9）载柚皮苷骨软骨复合支架的构建及其对兔骨软骨缺损修复的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 实验一 骨软骨复合支架的构建及其相关评价 |
| 1 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 软骨层支架的构建 |
| 2.2 骨层支架的构建 |
| 2.3 界面层的制备 |
| 2.4 骨软骨复合支架的构建 |
| 2.5 微球的评价 |
| 2.6 骨软骨复合支架的性能评价 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 微球评价 |
| 3.2 骨软骨复合支架的性能评价 |
| 4 讨论 |
| 实验二 骨软骨复合支架负载BMSCS的体外实验研究 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 BMSCs的培养 |
| 2.2 复合支架的生物相容性检测 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 BMSCs培养情况 |
| 3.2 CCK-8 法检测BMSCs增殖 |
| 3.3 BMSCs在软骨层、骨层支架表面生长情况 |
| 4 讨论 |
| 实验三 复合支架修复兔骨软骨缺损的体内实验研究 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验造模及分组情况 |
| 2.3 术后处理 |
| 2.4 CT观察 |
| 2.5 新生骨软骨大体形态观察 |
| 2.6 Micro CT观察 |
| 2.7 组织学染色观察 |
| 2.8 RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA的表达 |
| 2.9 Western blot法检测Ⅱ型胶原蛋白的表达 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 术后一般情况观察 |
| 3.2 CT观察 |
| 3.3 缺损处大体观察 |
| 3.4 Micro CT观察 |
| 3.5 HE染色观察 |
| 3.6 甲苯胺蓝染色观察 |
| 3.7 免疫组织化学染色观察 |
| 3.8 RT-PCR检测 |
| 3.9 Western blot检测 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 1 结论 |
| 2 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间发表论文及获奖情况 |
（10）川芎嗪对组织工程神经修复周围神经缺损作用的实验研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 川芎嗪对基因修饰或缺血缺氧损伤鼠胚神经干细胞的保护作用 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图表 |
| 第二部分 含川芎嗪培养液对种植神经干细胞的脱细胞神经桥接物的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图表 |
| 第三部分 组织工程化神经联合川芎嗪移植修复大鼠坐骨神经缺损 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图表 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的主要研究成果 |
四、我国组织工程实验研究的发展方向（论文参考文献）
- [1]3D打印多孔管状支架/水凝胶/缓释氧微球复合材料修复兔激素性股骨头坏死[D]. 王成强. 南方医科大学, 2021(02)
- [2]软骨脱细胞细胞外基质3D生物打印支架负载髌下脂肪垫间充质干细胞修复兔软骨病损的相关研究[D]. 吴俊. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [3]脂肪来源干细胞复合光敏化水凝胶3D生物打印构建组织工程软骨的实验研究[D]. 穆琳. 北京协和医学院, 2021(02)
- [4]hPDLSCs联合TGF-β3冻干海绵移植修复大鼠颅骨损伤及其机制研究[D]. 李杨帆. 暨南大学, 2020(03)
- [5]构建肌腱干细胞复合小牛冻干松质骨移植物的体外研究[D]. 王毅. 中国人民解放军医学院, 2019(03)
- [6]影响冠心病外科治疗预后的队列研究及新型导电生物材料在心肌梗死中的作用研究[D]. 陈尚霖. 北京协和医学院, 2019
- [7]仿生多通道人工神经导管的研究[D]. 亚穆罕默德·阿力克. 新疆医科大学, 2019(01)
- [8]带仿生血管网复合肌组织支架与体外组织工程化方法研究[D]. 董贵荣. 西安科技大学, 2018(01)
- [9]载柚皮苷骨软骨复合支架的构建及其对兔骨软骨缺损修复的实验研究[D]. 黄俊波. 甘肃中医药大学, 2017(08)
- [10]川芎嗪对组织工程神经修复周围神经缺损作用的实验研究[D]. 阳运康. 重庆医科大学, 2014(03)