一、人类血清在精子体外培养中对精子活力影响的观察分析（论文文献综述）
任发[1]（2021）在《奶山羊精子发生关键分子挖掘与性控精液研究》文中提出奶山羊产业是我国奶业发展的重要组成部分,而目前我国优质高产奶山羊存栏量不足,良种问题成为奶山羊种业发展面临的重大挑战。在生产中充分发挥优秀种公羊的繁殖力,对于奶山羊群体的遗传改良具有显着作用。雄性动物繁殖力依赖于精子发生,且在睾丸曲细精管中进行,包含精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂以及圆形精子细胞变形等过程,受到极其严格且精密的分子调控。当前高通量测序技术的发展使得人们进一步认识到精子发生中成千上万的分子变化,而这些关键分子的精确表达对于维持精子发生至关重要。然而,目前关于奶山羊精子发生的关键分子特征尚不清楚。此外,利用性控精液进行人工授精是快速扩繁高产奶山羊的有效途径,但性控精液在奶山羊方面仍有待进一步研究。因此,本研究以关中奶山羊为试验对象,利用免疫组织化学染色和组织观察法解析了奶山羊雄性生殖细胞与支持细胞的发育规律,并通过转录组学测序技术对精子发生潜在关键分子进行挖掘,在此基础上初步建立了一种奶山羊性控精液分选方法。本研究主要获得以下结果:1.采集8组不同日龄（15 d、30 d、45 d、60 d、75 d、90 d、180 d和240 d）的奶山羊睾丸组织,利用免疫组织化学染色和组织形态学观察,对雄性生殖细胞和支持细胞发育规律进行探究。结果表明:（1）奶山羊曲细精管直径随着睾丸发育而持续增加,且在75～90 d增长速度最快,在90 d时初次出现曲细精管管腔、圆形精子细胞和少量精子,提示奶山羊已经进入初情期。在180 d观察到大量精子,提示奶山羊已经进入性成熟阶段;（2）性原细胞在75 d前彻底转化为未分化精原细胞,未分化精原细胞在30 d启动分化,而在75～90 d未分化精原细胞增殖状态较为活跃,提示生精过程被激活;（3）SOX9和AMH均可作为奶山羊睾丸支持细胞的分子标记物,且AMH仅在未成熟的支持细胞中表达。支持细胞的增殖状态在45 d较为活跃,90 d后发育成熟。2.利用RNA-seq技术对奶山羊性成熟前（45 d）和性成熟后（240 d）的曲细精管组织进行转录组测序,挖掘并分析精子发生的关键lnc RNA和m RNA。结果表明:（1）在曲细精管组织中鉴定到11612个lnc RNA和18217个m RNA,其中性成熟前后差异表达lnc RNA和m RNA分别为7594和11986个;（2）挖掘出229个潜在精子发生关键m RNA,在性成熟后曲细精管样本中挖掘出KIT、DMRT1和SOX9等42个下调基因,DDX4、SYCP1和SYCP3等187个上调基因,发现PI3K/Akt、MAPK、AMPK、Ras和Rap1等信号通路可能调控精子发生;（3）在lnc RNA-m RNA互作网络发现TCONS＿00029023、TCONS＿00035144、TCONS＿00017872、TCONS＿00051085和TCONS＿00033882及其靶基因GSKIP、KAT8、MBD3L1、NANOS3和PRM3等关键分子可能参与调控奶山羊精子发生。3.采用单细胞转录组测序（single cell RNA sequencing,sc RNA-seq）技术对出生后45 d、90 d和180 d的奶山羊曲细精管单细胞悬液进行测序,从单细胞水平系统解析精子发生的关键分子特征。结果表明:（1）捕获了来自3个不同日龄曲细精管的25373个细胞,成功鉴定精子发生过程所包含的精原细胞、精母细胞、圆形精子细胞、支持细胞、间质细胞、巨噬细胞、内皮细胞等细胞类型及其在不同日龄的细胞数量占比;（2）挖掘出一批潜在的睾丸生殖细胞及体细胞标记基因,例如在精原细胞高表达SOHLH1、PAGE4和DMRT1,精母细胞高表达YBX2、HSPB9和LYPD4,圆形精子细胞高表达PRM2、SPEM1和PRSS37,支持细胞高表达AMH、INHA和EGR1,间质细胞高表达INSL3、ACTA2和STAR等,解析了睾丸体细胞与生殖细胞相互作用的关键信号通路（睾酮、维甲酸、PDGF、FGF和WNT通路等）及其分子特征;（3）通过Monocles算法对9个生殖细胞亚群进行拟时序分化轨迹分析,揭示了生殖细胞分化过程中精原细胞、精母细胞以及圆形精子细胞的关键分子特征,例如DMRT1、TOP2A和TNP1等,成功构建了奶山羊精子发生单细胞转录图谱。4.利用RNA-seq数据对奶山羊性染色体编码基因进行注释,挖掘性染色体关键分子并进行性控精液研究。结果表明:（1）在奶山羊性染色体上鉴定出ABCB7、ABCD1和ACE2等500个X染色体编码基因,以及SRY、USP9Y和UTY等9个Y染色体编码基因,挖掘出TLR7和TLR8等19个X染色体编码受体基因;（2）通过免疫组织化学染色发现TLR7/8蛋白在睾丸圆形精子细胞、附睾精子和成熟精子中均有表达,且TLR7/8阳性精子占比接近50%;（3）TLR7/8蛋白在奶山羊X精子尾部特异表达,激活TLR7/8信号通路后可通过GSK3α/β-己糖激酶途径降低X精子的线粒体活性和ATP水平,最终导致X精子运动能力下降;（4）利用分选所得X精子进行体外受精,获得雌性胚胎比例为80.52%±6.75%,雄性胚胎比例为19.48%±6.75%。综上所述,本研究在从组织学层面解析奶山羊雄性生殖细胞与支持细胞发育规律的基础上,利用RNA-seq和sc RNA-seq技术对奶山羊精子发生关键分子进行挖掘与分析,明确了雄性生殖细胞与支持细胞发育的关键时间节点,筛选出一批精子发生潜在关键基因和lnc RNA,鉴定了睾丸曲细精管的主要细胞类型并解析其关键分子特征,成功构建了奶山羊精子发生的单细胞转录图谱。此外,利用RNA-seq测序数据注释出X染色体和Y染色体编码的关键基因,并在此基础上初步建立了一种奶山羊性控精液分选方法。本研究将为奶山羊的分子育种和性控精液研究提供新的科学依据,同时为哺乳动物精子发生和雄性不育等相关研究提供理论参考。
曹[2]（2021）在《基于ROS-MAPK-线粒体途径探讨补肾益精方治疗少弱精子症的作用机制》文中研究表明少弱精子症（Oligozoospermia and Asthenozoospermia,OAZS）主要表现为精子密度和精子活力的下降,约占男性不育的50%～75%,是引起男性不育的重要原因之一。各种因素如不良生活方式、精索静脉曲张、系统疾病、遗传变异、激素异常、环境污染等都会不同程度地影响男性的生殖功能,且它们之间常常共存,导致精液中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生和精浆中抗氧化能力之间的动态平衡失调,引起氧化应激损伤,降低精子质量水平。OAZS生殖系统内过多的氧自由基、高活性氧的状态可以看作是中医学“血瘀”证候的一种表现形式,而“肾虚”则是“血瘀”的重要病因,正如《医林改错》中记载:“元气即虚,必不能达于血管,血管无气必停留而为瘀”。因此贾金铭教授认为“肾虚血瘀”是导致OAZS的基本病机,并以补肾活血,填髓益精立法创制了补肾益精方（YJD）,临床应用多年,疗效确切,可显着提高精子密度、精子活力及正常形态率等。本研究采用网络药理学与数据挖掘技术分析YJD的潜在药理机制,并以环磷酰胺复制的OAZS小鼠模型和体外培养的Leydig细胞及Sertoli细胞为载体,以ROS-OS-p38MAPK-线粒体途径为研究主线,探讨YJD抑制氧化应激损伤,提高精子质量的作用及机制。目的:传承创新名老中医学术经验,采用网络药理学方法探讨YJD治疗OAZS的作用机制,并通过体内外实验明确YJD抑制氧化应激损伤和细胞凋亡的作用,从ROS-OS-p38MAPK信号途径深入探讨其作用机制。方法:1 网络药理学分析:通过 TCMSP、Swiss Target Preduction、Pharm Mapper、UniProt、CTD、Genecards、String、David 等数据库;将 YJD12 种中草药采用MW≤500,AlogP≤10,Hdon≤5,HACC≤10,OB≥30%,DL≥0.18,CaCO-2≥-0.4七种仿制药原则筛选出这些成分中潜在的活性化合物及相对应的药物靶点,检索少弱精子症相关靶基因,两组交叉获取重合靶点,进行GO-BP及KEGG分析,从有效成分、潜在靶点、关键途径三个方面分析YJD治疗弱精子症的潜在药理机制。2动物实验:以环磷酰胺复制少弱精子症小鼠模型,通过睾丸--生精小管--睾丸间质细胞/支持细胞--线粒体--凋亡相关分子等多层次进行研究;采用ELISA、HE染色、细胞计数、流式分析、透射电镜、Western blot等手段,检测睾丸指数,生精小管形态及超微结构,血清TT、FT、LH、FSH,雄激素生成及利用相关蛋白 STAR、P450Scc、AR、ABP,睾丸/附睾组织ROS、MDA、SOD、GSH-Px,线粒体膜结构及功能,p38MAPK信号通路相关因子BAX、Bcl-2、Cyt-C、Caspase3等多纬度进行实验。3细胞实验:分别以TM3细胞（体外培养）和Sertoli细胞（原代提取）为研究对象,并制备YJD含药血清进行干预;采用siRNA干扰技术敲减目标基因p38MAPK,PCR检测敲减p38MAPK效率,CCK8检测细胞增殖情况,western blot检测敲减p38MAPK后相关指标的变化,从睾酮的合成分泌与利用两个方面进行实验。结果:1通过筛选,YJD12味中药共获得75个有效成分,对应190个潜在靶点;检索少弱精子症靶点共1125个（含少精子症713个,弱精子症412个）;两组交叉获得重合靶点30个;对30个重合基因进行拓扑分析,共获得9个核心指标:MAPK1、AR、ESR1、AKT1、MAPK8、EGFR、MMP9、PTGS2 和 MAPK14。30个重合靶点富集分析主要涉及细胞对脂质、有机化合物、有毒物质、活性氧、类固醇激素的反应;细胞对激素刺激、氧化应激、外界刺激、炎症反应的反应;及生殖系统/结构调节等生物学过程;及MAPK信号通路、胰岛素信号通路、TNF信号通路、雌激素信号通路、P53信号通路、神经营养蛋白信号通路、T细胞受体信号转导途径、cAMP信号通路及FoxO、VEGF等信号通路。2环磷酰胺建立少弱精子症模型小鼠的睾丸指数及体积减小（P<0.05,P<0.01）;精子密度和活力下降（P<0.01）;血清TT、FT水平下降（P<0.01）,血清FSH、LH水平增加（P<0.01）;睾丸及附睾组织中ROS、MDA含量明显增加（P<0.01）,SOD、GSH-Px含量减少（P<0.01）;生精小管结构紊乱;线粒体结构和功能下降;p38MAPK、Caspase3、BAX、Cyt-C蛋白表达水平增加（P<0.05,P<0.01）,Bcl-2、STAR、P450scc、AR、ABP 蛋白表达水平降低（P<0.05,P<0.01）;给予YJD治疗后,OAZS模型小鼠睾丸指数无明显变化（P>0.05）,睾丸体积增加（P<0.01）;精子密度和活力增加（P<0.01）;血清TT、FT水平增加（P<0.01）,血清FSH、LH水平降低（P<0.01）;睾丸及附睾组织中ROS、MDA含量明显减少（P<0.01）,SOD、GSH-Px含量增加（P<0.01）;生精小管结构及线粒体结构和功能改善;p38MAPK、Caspase3、BAX、Cyt-C蛋白表达水平降低（P<0.05,P<0.01）,Bcl-2、STAR、P450scc、ABP 蛋白表达水平增加（P<0.05,P<0.01）;AR蛋白水平无明显变化（P>0.05）。3 在敲减 TM3 细胞中 p38MAPK 后,p38MAPK、Caspase3、Cyt-C、STAR及P450scc蛋白水平表达量均明显下调（P<0.05）,BAX和Bcl-2蛋白相对表达量无明显变化（P>0.05）;以10%YJD含药血清干预细胞12h后,上述除Bcl-2上调外,其他指标蛋白表达水平再次出现明显下调（P<0.01）。在敲减Sertoli细胞中 p38MAPK 后,p38MAPK、Caspase3、Cyt-C、BAX 及 AR 蛋白水平表达量均明显下调（P<0.05）,ABP及Bcl-2蛋白相对表达量无明显变化;以10%YJD含药血清干预细胞12h后,p38MAPK、Caspase3、Cyt-C及BAX蛋白水平表达量再次明显下调（P<0.01）,Bcl-2蛋白相对表达量明显上调（P<0.05）,AR及ABP蛋白相对表达量无明显变化（P>0.05）。结论:补肾益精方（YJD）能够通过ROS/OS/p38MAPK-线粒体途径改善环磷酰胺制备少弱精子症（OAZS）小鼠模型,及Leydig细胞和Sertoli细胞模型的氧化应激（OS）损伤,改善线粒体结构及功能,从睾酮的分泌合成与利用等方面,促进精子发生和成熟,提高精子密度和活力,治疗少弱精子症。
徐冰冰[3]（2021）在《基于多组学联合分析对内蒙古绒山羊精液抗冻性的研究》文中进行了进一步梳理内蒙古绒山羊是我国重要的地方种质资源。优秀种公羊冷冻精液的生产推广,能够提高种公畜的利用效率,加速育种工作进程,为生产带来更高的经济效益。但内蒙古绒山羊冷冻精液活力不稳定,情期受胎率低,解冻后精液品质具有明显的个体抗冻性差异。为了建立一种高效的内蒙古绒山羊精液冷冻保存体系,本研究以内蒙古绒山羊为研究对象,采集精液,利用统一的冷冻解冻程序进行精液抗冻性筛选,并将其分为高抗冻组（High Freezability,HF）和低抗冻组（Low Freezability,LF）,初步评估精子和精浆对内蒙古绒山羊精液抗冻性的影响。对内蒙古绒山羊HF组和LF组精浆进行蛋白质组-代谢组学联合分析,鉴定精浆中影响精液抗冻性的可能因素,其次利用脂质组学分析方法对内蒙古绒山羊HF组与LF组解冻后精子进行脂质差异表征。主要研究结果如下:（1）内蒙古绒山羊精液在冷冻-解冻后呈现抗冻性的个体差异,HF组冷冻解冻后精子各项运动参数以及结构完整性均显着高于LF组。精子和精浆的差异会影响精液抗冻性。（2）利用TMT（Tandem mass tags）标记定量蛋白质组学分析技术,从蛋白水平检测到HF组和LF组精浆间差异显着表达的蛋白质115个,HF组精浆中上调的蛋白质44个,LF组中上调的蛋白质71个。差异蛋白质GO（Gene Ontology）功能富集到22个生物学过程,14个细胞组分,10个分子功能。通过KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析,115个差异蛋白覆盖91条通路。差异表达蛋白中UQCRC1、DNAH1、APOA1、ADAM32、HTT、CADM1、STIP1是内蒙古绒山羊精液抗冻性的潜在生物标记。（3）利用非靶向代谢组学分析技术,从代谢水平检测HF组和LF组精浆间的差异,在正、负离子电离模式下均能很好地将HF组与LF组精浆区分,二者具有明显代谢差异。在正离子模式下鉴定到HF组与LF组间差异代谢物23种,在负离子模式下鉴定到HF组与LF组间差异代谢物18种,富集到17条代谢通路。变量权重值（Variable Importance for the Projection,VIP）最大的前15种差异代谢物是柠檬酸盐、Pro-Arg、酮异己酸、乙酰肉碱、L-谷氨酰胺、次黄嘌呤、L-焦谷氨酸、20-羟基-前列腺素F2a、15-酮-前列腺素E1、L-亮氨酸、酪胺、泛酸、油酸、L-苯丙氨酸和二氢胸腺嘧啶,这些代谢物可以作为内蒙古绒山羊精液抗冻性的潜在生物标记。（4）通过蛋白质组-代谢组学联合分析将得到的差异蛋白质和差异代谢物同时向KEGG通路投射,富集到11条通路,差异蛋白质和差异代谢物在矿物质吸收通路上显着富集,其中包含的差异蛋白为LOC102172488和FTH1,差异代谢物分别是L-谷氨酰胺、L-苯丙氨酸和L-亮氨酸。差异蛋白质TF与LOC102172488具有较高的序列一致性,且TF与FTH1均富集在矿物质吸收通路。TF与FTH1在HF组与LF组解冻后精子中均有表达,且LF组中TF蛋白的表达量显着高于HF组,HF组精子中FTH1蛋白的表达量显着高于LF组。检测HF组与LF组精浆中矿物离子的含量,发现HF组精浆中Fe2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Cr3+含量显着高于LF组。说明Fe的转运、氧化及储存可能影响内蒙古绒山羊精液抗冻性,且精浆中Fe2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Cr3+的浓度与精液抗冻性有关。（5）利用非靶向脂质组学分析内蒙古绒山羊HF组与LF组冷冻解冻后精子的脂质特征。在正、负离子电离模式下,HF组和LF组精子均能很好的区分,说明两者间存在差异显着的脂质特征。共鉴定到29个脂质亚类,1133个脂质分子,检测到显着差异脂质分子13个,分别其中3个属磷脂酰胆碱亚类（Phosphatidylcholine,PC）,10个属甘油三酯亚类（Triglyceride,TG）。说明精子膜上PC分子和TG分子能够显着影响内蒙古绒山羊精子冷冻耐受性。本研究为阐明内蒙古绒山羊精液抗冻性调控机制,基于多组学联合分析分别研究精浆和精子对抗冻性的影响。发现精子和精浆中均存在影响精液抗冻性的因素,并筛选到精浆中影响精液抗冻性的潜在生物标记,且精浆中矿物质离子含量与抗冻性有关;精子的脂质差异是影响解冻后精子活力的关键。通过以上研究,期望对内蒙古绒山羊精液抗冻性有更好的认识,为提高解冻后精液品质,建立内蒙古绒山羊精液冷冻保存体系提供理论依据。
栾兆进[4]（2021）在《雄激素对绵羊附睾谷胱甘肽过氧化物酶5抗氧化的调节机制研究》文中认为附睾上皮细胞（Epididymis epithelial cells,EECs）形成的附睾腔微环境对维持精子的正常成熟起着关键作用,活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）是细胞氧化还原代谢的副产物,附睾中适量的ROS通过调节c AMP水平在精子成熟和获能的生理过程中起重要作用,而过量的ROS会使精子受到氧化应激的损伤,因此,维持附睾腔微环境的氧化还原平衡对于精子成熟具有主要的作用。谷胱甘肽过氧化物酶5（Glutathione Peroxidase 5,GPX5）在附睾中高表达,目前,没有关于绵羊EECs中GPX5功能及其调节的研究报道。因此,本实验在优化绵羊附睾上皮细胞体外培养条件的基础上,研究了雄激素对绵羊附睾上皮细胞中GPX5功能的调节机制,研究结果如下:1.EGF对绵羊EECs体外增殖的影响。采用CCK-8法测定细胞生长情况,RT-PCR检测EECs中功能标记基因GPX5和AR表达,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,Western blot检测细胞中EGFR、AKT和FOXO1磷酸化水平。结果显示50 ng/m L EGF可以显着促进EECs的增殖,且不同代EECs细胞均可正常表达GPX5和AR基因;EGF极显着提高了处于S期的细胞比例（P<0.01）,显着降低了细胞凋亡指数（P<0.05）。与对照组相比,EGFR抑制剂Gefitinib的添加极显着降低了处于S期的细胞比例（P<0.01）,凋亡指数极显着升高（P<0.01）;PI3K/AKT抑制剂LY294002的添加显着降低处于S期的细胞比例（P<0.05）,但凋亡指数无显着变化（P>0.05）。与对照组相比,EGF可以极显着提高EECs细胞的EGFR、AKT和FOXO1磷酸化水平（P<0.01）;与EGF组相比,EGF+Gefitinib组EECs中EGFR、AKT和FOXO1磷酸化水平极显着降低（P<0.01）,而EGF+LY294002组EECs的AKT和FOXO1磷酸化水平呈极显着降低（P<0.01）。2.海藻糖对绵羊EECs体外增殖的作用。利用酶标仪检测EECs增殖情况,RT-PCR检测不同传代的EECs功能标记,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,DCFH-DA检测细胞内ROS水平,酶化学法检测细胞内抗氧化剂水平,q RT-PCR和ELISA检测细胞GPX5的表达。结果表明:100 mmol/L海藻糖有效地提高EECs的生长能力,极显着增加处于S期细胞比例（P<0.01）,并极显着降低凋亡率（P<0.01）;100 mmol/L海藻糖培养的EECs在体外可连续传代14次,而且标记基因GPX5和AR正常表达。与对照组相比,100 mmol/L海藻糖处理的细胞ROS极显着降低（P<0.01）,CAT和GPXs活性分别呈极显着（P<0.01）和显着（P<0.05）升高,GPX5的m RNA和蛋白表达分别表现出极显着（P<0.01）和显着（P<0.05）上调。3.绵羊EECs中GPX5的抗氧化作用。采用si RNA干扰绵羊EECs的GPX5基因表达,分为si RNA-GPX5、si RNA-NC转染对照组和对照组,采用CCK-8检测细胞增殖,DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平,采用TBA法检测细胞内MDA含量,免疫荧光检测细胞内8-OHd G水平,q RT-PCR检测EECs中主要的抗氧化基因的m RNA表达量。结果表明:随着H2O2处理浓度的增加,与对照组相比,si RNA-GPX5组的增殖能力不断下降。与对照组相比,si RNA-GPX5细胞中的ROS含量和MDA产生量分别呈极显着（P<0.01）和显着（P<0.05）的升高,si RNA-GPX5细胞中的8-OHd G水平明显的增多。si RNA-GPX5+T组细胞中GPX1和GPX3的m RNA表达量较si RNA-GPX5处理组有显着的升高（P<0.05）,SOD和GPX4的m RNA表达量比si RNA-GPX5处理组有极显着的升高（P<0.01）。4.睾酮、AR及其共调节因子对绵羊EECs中GPX5的调节作用。采用CCK-8检测不同浓度睾酮处理的EECs增殖情况,q RT-PCR检测GPX5、AR、SRC-1、CBP、p300、NCOR2 m RNA表达量,免疫荧光法和Western Blot法检测GPX5、AR、SRC-1、CBP、p300、NCOR2的表达量,双荧光素酶报告基因检测AR与GPX5基因的结合作用、结合位点以及AR转录活性。结果表明,外源性睾酮对EECs的增殖呈现浓度依赖性,其中,100 nmol/L睾酮组的细胞生长最好。100 nmol/L睾酮组的细胞GPX5m RNA和蛋白表达量极显着高于对照组（P<0.01）,而1 000 nmol/L睾酮组细胞GPX5 m RNA和蛋白表达量与对照组差异不显着（P>0.05）,却分别极显着（P<0.01）和显着（P<0.05）低于100 nmol/L睾酮组。与对照组相比,100 nmol/L睾酮组AR在细胞核中的表达明显增多（P<0.05）,AR m RNA和蛋白表达量分别呈极显着（P<0.01）和显着（P<0.05）的提高;然而1 000 nmol/L睾酮组细胞AR m RNA和蛋白的表达量显着低于对照组（P<0.05）。1 000 nmol/L睾酮组细胞CBP、p300、SRC-1蛋白表达呈现极显着增高（P<0.01）,特别是核内的表达量增高明显。si RNA-AR组细胞GPX5 m RNA和蛋白的表达量与对照组差异不显着（P>0.05）。pc DNA3.1-AR组GPX5 m RNA和蛋白表达量较对照组呈极显着（P<0.01）和显着（P<0.05）升高。p GL3-GPX5-pro-wt+pc DNA3.1-AR组的荧光素酶活性显着高于p GL3-GPX5-pro-wt+pc DNA3.1组（P<0.05）,与p GL3-GPX5-pro-wt相比,p GL3-GPX5-pro-mut1组荧光素酶活性显着下调（P<0.05）。si RNA-AR组细胞SRC-1和p300蛋白表达量极显着高于对照组（P<0.01）。si RNA-SRC-1组细胞GPX5 m RNA和蛋白表达量较对照组显着的降低（P<0.05）,si RNA-p300组细胞GPX5的m RNA和蛋白的表达量均显着低于对照组（P<0.05）。si RNA-SRC-1和si RNA-p300组细胞AR蛋白表达量与对照组差异不显着（P>0.05）,si RNA-SRC-1和si RNA-p300组的细胞AR的转录活性显着降低（P<0.05）。综上所述,EGF通过EGFR/PI3K/AKT通路上调FOXO1的磷酸化增强绵羊EECs体外生长能力。海藻糖通过增加CAT、GPXs的酶活性和GPX5的表达量发挥抗氧化活性以促进EECs的体外增殖。GPX5可以有效地保护绵羊EECs免受脂质过氧化损伤及DNA的氧化损伤。睾酮对绵羊EECs GPX5、AR及其共调节因子的表达具有浓度依赖性的调节效应,睾酮通过AR及其共调节因子SRC-1和p300/CBP调节GPX5表达,AR以靶向结合的方式促进GPX5转录。SRC-1和p300/CBP可以提高AR转录活性,在AR表达明显降低时维持靶基因GPX5的表达量。
范小瑞[5]（2021）在《猪隐睾睾丸精子发生障碍的分子机制研究》文中研究指明目的:自发性单侧隐睾公猪是一侧睾丸位于腹部或腹股沟管,这使得睾丸接近或位于体温环境。不同品种的仔猪中,单侧隐睾的发病率为2%。猪隐睾症主要关注的问题是,腹部异常高温导致隐睾睾丸正常精子发生中断。生殖细胞的建立和维持是保证一个物种生存的关键,受多种因素的影响,其中温度是最主要的因素。雄性生殖细胞（精子）是由精子发生的复杂过程产生的。精子发生是在低于核心体温2-8°C的阴囊温度下进行。睾丸暴露在体温环境导致精子发生阻滞,但具体的分子机制尚不清楚。自发性单侧隐睾是研究体温对精子发生影响的良好动物模型。方法:本研究以断奶前仔猪（20d,15Kg左右,4头）、隐睾和对侧阴囊公猪睾丸（7-9月龄,140-150Kg,4头）为研究对象,手术摘取两侧睾丸,部分置于液氮,用于提取总mRNA和蛋白,以及进行RNA-seq和i TARQ检测;部分置于Bouin氏固定液中,用于TUNEL、HE染色和免疫组织化学分析。雄性健康SD大鼠（30d,90～100g,6只）,手术诱导单侧隐睾,隐睾30d,3只手术摘取两侧睾丸,置于Bouin氏固定液中,用于免疫组织化学分析;3只用生物素示踪法检测两侧睾丸血睾屏障通透性变化。结果:1.自发单侧隐睾公猪睾丸支持细胞和生殖细胞数量的变化HE染色结果显示,与对侧阴囊睾丸相比,隐睾睾丸只含有支持细胞和少量精原细胞,未见减数分裂后的生殖细胞。形态计量学研究结果显示,与对侧阴囊睾丸相比,隐睾睾丸生殖细胞总数显着减少,支持细胞总数无显着变化;较断奶前仔猪睾丸,隐睾睾丸生殖细胞和支持细胞总数均显着增加。2.自发单侧隐睾对公猪睾丸增殖和凋亡相关蛋白表达与定位的影响TUNEL结果显示,精原细胞凋亡信号明显减少。qRT-PCR和Western Blot结果显示,隐睾组中PCNA和Bax的蛋白和mRNA水平显着降低;细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达升高。免疫组织化学结果显示,PCNA表达于精原细胞的细胞核。隐睾导致Bax在精原细胞的重新分配,从细胞质转移至细胞核表达。Bcl-2在各实验组中优先表达于近管腔部位生殖细胞的细胞质和细胞核。与对侧阴囊组相比,隐睾组PCNA阳性细胞和TUNEL阳性细胞减少。3.自发单侧隐睾对公猪睾丸自噬相关蛋白表达与定位的影响qRT-PCR和Western Blot结果显示,隐睾组中LC3和Beclin1的蛋白和mRNA水平显着降低;p62的表达显着升高。免疫组织化学结果显示,LC3表达于精原细胞的细胞质。与对侧阴囊组相比,隐睾组LC3阳性细胞减少。4.自发单侧隐睾对公猪睾丸血睾屏障紧密连接分子表达与定位的影响qRT-PCR和Western Blot结果显示,隐睾组中Claudin-11的蛋白和mRNA水平显着升高;Occludin和ZO-1蛋白和mRNA水平显着降低。免疫组织化学结果显示,隐睾导致Claudin-11、Occludin和ZO-1的异位表达:由细胞膜转移至细胞质表达。5.单侧隐睾对大鼠睾丸血睾屏障通透性的影响免疫组织化学结果显示,隐睾导致Claudin-11和ZO-1的异位表达:由细胞膜转移至细胞质表达。生物素示踪结果显示,生物素进入隐睾睾丸管腔。6.转录组学分析自发单侧隐睾对公猪睾丸基因表达的影响RNA-seq结果显示,断奶前仔猪和隐睾睾丸组织比较,共有6901个差异表达基因,其中4603个上调,2298个下调。隐睾和对侧阴囊睾丸组织比较,共有13873个差异基因,其中8216个上调,5657个下调。GO富集分析显示,隐睾睾丸和断奶前仔猪睾丸相比,较多差异基因的功能与细胞黏附、细胞发展和精子发生等有关;隐睾和对侧阴囊睾丸组相比,较多差异基因的功能与精子发生、细胞分化和细胞迁移等有关。KEGG Pathway富集分析显示,断奶前仔猪与隐睾睾丸相比,差异基因较多富集于代谢、ECM受体相互作用和细胞黏附等信号通路。隐睾睾丸与对侧阴囊睾丸相比,差异基因较多富集于物质代谢、细胞黏附分子（CAMs）和信号转导相关通路（凋亡、吞噬、Ras和MAPK通路）等,且CAMs通路相关基因大多上调表达,包括CLDN11（Claudin-11）。下调基因中Nectin-3在细胞黏附、迁移和极化中发挥作用。7.蛋白质组学分析自发单侧隐睾对公猪睾丸蛋白表达的影响结果显示,隐睾组和断奶前仔猪相比,1459个差异蛋白:773个上调,686个下调;隐睾组和对侧阴囊组相比,1424个差异蛋白:656个上调,768个下调。GO富集分析显示,隐睾组和断奶前仔猪相比,较多差异蛋白的功能与细胞黏附、代谢和胞外基质等有关;隐睾组和对侧阴囊组相比,较多差异蛋白的功能与精子发生、繁殖和能量代谢有关。KEGG Pathway富集分析显示,隐睾组和断奶前仔猪相比,差异蛋白主要富集在黏着斑信号、DNA复制和视黄醇代谢通路。隐睾组和对侧阴囊组相比,差异蛋白主要富集在DNA复制、蛋白酶体、缝隙连接和黏着连接通路。SDR5A1和CYP11A等的下调表达,提示睾酮合成和代谢受阻。结论:隐睾导致猪睾丸生殖细胞增殖不足,过度凋亡和自噬;支持细胞结构和功能受损,血睾屏障（BTB）通透性增加,支持细胞供能不足,最终导致猪睾丸生精障碍。
葛闻博[6]（2021）在《褪黑素在绵羊附睾中的合成及其对附睾上皮细胞生理功能的调控研究》文中研究指明附睾形态和功能的完整性是依赖雄激素的,而双氢睾酮（Dihydrotestosterone,DHT）是最有效的雄激素之一。双氢睾酮在维持第二性征和精子的成熟与储存方面具有重要的调控作用。双氢睾酮的分泌过程需要两种还原酶5α-red1和5α-red2的参与和调节。褪黑素是一种主要由松果体合成分泌的吲哚类激素。它对多种哺乳动物睾丸及附睾生殖生理功能有调控作用,然而褪黑素及其合成酶AANAT和HIOMT及膜受体MT1和MT2在绵羊附睾中合成及表达模式及对附睾生理功能的调控尚不清楚。本研究以绵羊附睾为研究对象,运用液相质谱联用、实时荧光定量PCR（RT-q PCR）、蛋白免疫印迹（Western blotting）、免疫组织化学、组织和细胞免疫荧光等方法,探究绵羊附睾中褪黑素的合成和受体的表达;褪黑素对绵羊附睾尾中双氢睾酮合成及其合成酶表达的影响;蛋白质组学层面褪黑素对绵羊附睾功能的调控;褪黑素对绵羊附睾尾上皮细胞炎症反应的调控机制。得到的结果如下:1.褪黑素及其合成酶AANAT、HIOMT、MT1和MT2在绵羊附睾中的合成免疫组织化学和免疫荧光结果显示AANAT、HIOMT、MT1和MT2在附睾头、体和尾上皮细胞和平滑肌细胞中均有分布,且主要分布在附睾上皮细胞中。液相质谱联用测得褪黑素在附睾尾中的含量显着高于附睾头和体。RT-q PCR和Western blotting结果显示,与液相质谱联用结果相似,AANAT、HIOMT、MT1和MT2在附睾尾中的m RNA和蛋白水平最高。同时绵羊精子免疫荧光和Western blotting显示MT1和MT2主要定位于精子颈部和尾部,表达量随着精子的成熟程度增加而增加。2.褪黑素对绵羊附睾尾上皮细胞中DHT合成的影响通过酶消化法体外培养绵羊附睾尾上皮细胞,并用不同浓度的褪黑素及luzindole（N-acetyl-2-benzyltryptamine）（MT1和MT2非选择性拮抗剂）和4P-PDOT（4-phenyl-2-propionamidotetralin）（MT2选择性拮抗剂）处理附睾尾上皮细胞。通过ELISA、q PCR和western blotting实验发现,10-9、10-8和10-7M褪黑素显着抑制了附睾尾上皮细胞中DHT合成,并且10-10-10-7M褪黑素显着抑制了DHT合成酶5α-red1和5α-red2 m RNA和蛋白表达。另外,细胞免疫荧光检测发现MT1和MT2表达于附睾尾上皮细胞中。褪黑素和4P-PDOT或luzindole共同处理阻断了附睾尾上皮细胞中褪黑素对DHT合成和5α-red1和5α-red2表达的抑制作用,并且luzindole的阻断作用更加显着。3.附睾头上皮细胞iTRAQ蛋白质组学分析本实验通过蛋白质组学iTRAQ技术分析鉴定10-7 M褪黑素处理后,绵羊附睾头上皮细胞中的差异表达蛋白。经过生物学技术分析共发现69个差异表达蛋白,其中褪黑素处理后的附睾头上皮细胞中41个上调蛋白,28个下调蛋白。另外通过q PCR和western blotting技术验证了6个差异表达蛋白SOD、COL1A1、COL1A2、PRM1、NQO2和FN1的表达。结果显示这些蛋白的表达趋势和iTRAQ分析结果相符,这说明iTRAQ分析结果是可靠的。同时通过生物信息学分析发现褪黑素可通过调节抗氧化和抗炎反应等过程中的相关蛋白水平从而参与对附睾上皮细胞功能的调节。4.褪黑素对绵羊附睾尾上皮细胞炎性反应的影响通过酶消化法体外培养绵羊附睾尾上皮细胞,使用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）建立体外炎症模型。利用q PCR和western blotting技术检测褪黑素对LPS诱导的绵羊附睾尾上皮细胞炎症反应的调控作用。结果显示,LPS能明显增加绵羊附睾尾上皮细胞中TLR4/NF-κB信号通路中相关蛋白及炎性相关因子的表达;然而褪黑素处理后显着降低了附睾尾上皮细胞TLR4/NF-κB通路相关蛋白及炎性相关因子的表达。此外,使用褪黑素MT1和MT2拮抗剂4P-PDOT和luzindole共处理附睾尾上皮细胞,均显着阻断了褪黑素对LPS诱导的附睾尾上皮细胞TLR4/NF-κB通路相关蛋白及炎性相关因子的表达的抑制作用。综上所述,绵羊附睾头、附睾体和附睾尾中均有褪黑素的合成途径及褪黑素相关蛋白的表达,并且褪黑素能通过MT1和MT2调控附睾DHT的合成。此外,褪黑素可通过抗氧化和抗炎等途径参与对绵羊附睾头上皮细胞功能的调节,并且褪黑素有效地抑制了LPS诱导的绵羊附睾尾上皮细胞的炎症反应,其可能机制为褪黑素通过MT1和MT2下调TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达,从而降低了炎性因子的表达。本实验结果为进一步研究褪黑素对雄性动物生殖机理的调控机制提供了基础。
吴迪[7]（2020）在《双酚AF对小鼠血睾屏障和精子发生的影响及其机制研究》文中研究表明环境污染是伴随社会化进程不可避免的社会生态学问题,其对生物个体及生态链的影响亦日益备受关注。生殖系统作为传递动物遗传物质的器官,同时也是对环境污染物最敏感的系统之一。人类生殖障碍导致人口缓慢或负增长以及新生儿出生缺陷等严重社会和经济学问题,就畜牧业而言,动物生殖障碍则会影响市场经济效益。因此,从分子水平阐明环境污染物的作用机制对于改善和提高人类和动物生殖能力具有重要意义。双酚AF（Bisohenol AF,BPAF）作为双酚A（Bisohenol A,BPA）的氟化同系物广泛应用于食品包装聚合物和医药中间体等产品中,在生产和使用过程中被释放至环境中,对生态环境和动物具有潜在的危害。环境介质、消费产品、食品乃至人体体液中均能检测到BPAF的存在,而且BPAF在雌激素、抗雌激素和抗雄激素活性方面具有比BPA更高的内分泌干扰效应,同时具有神经毒性、发育毒性和生殖毒性。但目前仍缺乏饮食和非饮食性接触BPAF是否对动物生殖健康具有潜在危害的系统性研究。本研究以雄性小鼠为研究对象,经口分别连续28天给予0,5,20和50 mg/kg/d BPAF,建立对照及低,中,高剂量BPAF亚急性接触模型,通过检测小鼠生长,睾丸脏器系数,精子数量,精子活力,精子内ATP,ROS和钙离子水平,血清中雄激素水平及血睾屏障完整性等全面评估BPAF的生殖毒性,并探究BPAF诱导雄性生殖损伤的作用机制。主要研究结果如下:（1）与对照组相比,BPAF接触对动物体重增长和睾丸附睾发育无显着影响,曲细精管结构和附睾尾上皮结构完整无显着变化。然而,BPAF接触会导致血清中睾酮水平显着下降。此外,中剂量组（20 mg/kg/d BPAF）和高剂量组（50 mg/kg/d BPAF）附睾尾精子数量分别下降30.9%和44.6%。（2）与对照组相比,高剂量组（50 mg/kg/d BPAF）附睾尾精子内ROS和钙离子水平显着增加。中剂量组（20 mg/kg/d BPAF）和高剂量组（50 mg/kg/d BPAF）精子内抗氧化酶PRDX5和SDHB蛋白表达水平显着下降,抗氧化酶GPX4和DNA损伤蛋白γH2AX表达水平显着上升,表明BPAF能破坏精子内抗氧化体系。此外,20 mg/kg/d和50 mg/kg/d剂量组精子顶体完整率显着下降表明畸形精子产生增加。（3）中剂量组（20 mg/kg/d BPAF）和高剂量组（50 mg/kg/d BPAF）附睾尾精子内蛋白质翻译后修饰方式发生改变,表现为泛素化和SUMO2/3螯合物水平下调而SUMO1螯合物水平上调。此外,作为转录抑制表观遗传学标记的H3K27me3修饰水平也显着性上调。（4）在对照组中睾丸中,生物素示踪剂被限制在靠近基底膜的基膜处,而中剂量（20 mg/kg/d BPAF）和高剂量（50 mg/kg/d BPAF）处理组睾丸内生物素示踪剂可穿过血睾屏障弥散至近腔小室,同时高剂量组（50 mg/kg/d BPAF）睾丸内紧密连接蛋白ZO-1、缝隙连接蛋白p-Connexin 43和细胞骨架调节蛋白Palladin的表达水平出现显着下调,表明BPAF能破坏血睾屏障的完整性和功能。（5）为进一步证实BPAF对血睾屏障的影响,本研究采用0,5,25,50μM BPAF（对支持细胞活力无显着影响）处理原代支持细胞以探究其作用机制。结果表明,50μM BPAF处理能显着下调支持细胞TER,同时紧密连接蛋白ZO-1、紧密连接调节蛋白FAK、缝隙蛋白p-Connexin 43和细胞骨架调节蛋白Palladin的表达水平也出现明显下调,进一步证实了BPAF能破坏支持细胞屏障功能。。（6）中剂量组（20 mg/kg/d BPAF）和高剂量组（50 mg/kg/d BPAF）睾丸内丝裂原蛋白激酶,磷酸化ERK/MAPK水平显着增加。为进一步探究BPAF是否通过激活ERK信号通路从而破坏BTB功能,在50μMBPAF处理前,使用10μM ERK特异性抑制剂U0126预处理支持细胞1h。结果表明,U0126处理能显着缓解BPAF诱导支持细胞屏障功能下降,并抑制BPAF诱导的紧密连接调节蛋白FAK和细胞骨架调节蛋白Palladin表达水平的下调以及支持细胞骨架的紊乱。综上所述,本研究发现BPAF损伤雄性小鼠睾丸功能,通过靶向支持细胞激活ERK/MAPK信号通路从而扰乱细胞骨架,破坏BTB结构和功能,进而影响精子发生过程。本研究初步探讨BPAF影响精子发生的作用机制,为双酚类化合物的生殖危害评价以及缓解和预防BPA替代物带来的潜在危害提供重要参考依据。
赵海霞[8]（2020）在《许氏平鲉精子长期储存及能量代谢研究》文中研究说明精子储存是一种广泛存在于体内受精物种中十分普遍的繁殖策略。卵胎生硬骨鱼许氏平鲉从交尾到受精,精子储存时间长达6个月。目前,对于卵胎生鱼类精子在雌鱼体内的储存位置、活力状态、能量供应相关研究较少。本研究以许氏平鲉为研究对象,观察许氏平鲉精子超微结构,并与卵生硬骨鱼大菱鲆比较分析体内受精许氏平鲉精子特殊结构特征;通过组织学与精子生理状态检测,分析了许氏平鲉精子从交尾到受精期间在卵巢的储存位置的动态变化;通过精子、血清和卵巢液成分组成、药物实验以及卵巢液组分解析初步明确精子能量底物与供应途径。主要研究结果显示:1.分析了许氏平鲉的超微结构:在10月份交尾时采集精子进行结构分析,许氏平鲉精子由头部,中段和尾部构成,且头部无顶体。许氏平鲉精子头部细长,短棒状,长径:3.15±0.17μm,短径:1.44±0.10μm;中段长1.23±0.48μm,两侧不对称,呈囊袋状,线粒体呈垛叠状紧密排列在中段,约有3-4层,约30-40个线粒体;尾部侧鳍较发达,尾部鞭毛轴丝为“9+2”微管结构。交尾时,许氏平鲉精子结构发育完整,且可被卵巢液激活迅速运动。与体外受精硬骨鱼相比许氏平鲉精子拥有细长的头部,发达的中段,线粒体数量较多,这些结构的差异也是对其体内受精和长期储存特性的适应性进化。2.描述了精子在卵巢内长期储存的动态变化:10月份许氏平鲉交尾完成,至次年3-4月份受精,精子储存于卵巢长达半年之久。10月至12月,可以直接从卵巢液中观察到快速游动的精子（VCL=67.04±2.51μm/s）,大多数精子随机散布在卵巢腔内或集中在滤泡复合体外侧上皮细胞形成的隐窝中,卵巢处于Ⅲ期前卵黄积累期,卵巢中以皮质小泡期卵母细胞为主,细胞膜边缘开始出现卵黄颗粒;12月下旬2月,卵巢处于Ⅳ期卵黄积累期,由于间质细胞的增生,部分精子散布在间质细胞之间,大多数精子储存在滤泡层外的小腔中,此时不能从卵巢液中观察到活动的精子;3月份卵巢逐渐发育成熟,精子储存于滤泡层外的小腔中。由此推测:交尾后,精子在卵巢中游动,随机分布,于次年12月,精子停止运动,由于卵子周边间质细胞发育,精子主动或被动裹入卵母细胞外滤泡层与间质细胞外小腔,直至受精前,被卵巢液激活完成受精过程。3.初步查明精子长期储存主要能量供应物质与能量代谢方式:借助相关试剂盒,对许氏平鲉卵巢液与精子葡萄糖、果糖、甘油、丙酮酸、乳酸、柠檬酸进行检测,发现许氏平鲉卵巢液底物组分含量与精子相似,能量物质组分中果糖含量、甘油、乳酸含量较高,卵巢液物质含量在1月达到峰值,3月达到最低值。许氏平鲉精子可以利用外界底物支持自身生命活动,体外实验证明外源能量底物葡萄糖、果糖等添加可以有延长精子寿命,最长可达85±5 h,增长了40%,但未显着影响精子运动学参数,同样添加碘醋酸钠抑制糖酵解途径,运动相关参数变化不显着。与之相反添加FCCP与鱼藤酮抑制氧化磷酸化途径,可以使精子的运动率指标（运动率、前向运动率）,速率指标（VCL、VAP、VSL）,运动特征参数（BCF、STR、LIN、WOB）显着降低。由此推测:体外实验糖酵解底物的添加可以有效延长精子搜狐名,氧化磷酸化可能在交尾和受精前的快速激活运动的能量供应中发挥了重要作用。4.通过非靶向代谢组初步探索了许氏平鲉精子储存期微环境:在正离子模式下,许氏平鲉卵巢液相较于大菱鲆卵巢液共筛选出9077种物质,其中122种物质含量显着上调,20种物质含量显着下调,差异倍数大于40倍的物质共20种,17种为二肽;负离子模式下,筛选出7125种物质,其中44种物质显着上调,23种物质显着下调。Protein digestion and absorption（蛋白质消化与吸收）,ABC transporters（ABC转运超家族）等通路发生了显着变化。其中protein digestion and absorption通路中共有15种物质富集到该通路。在ABC transporters通路种21种差异代谢物富集到本通路,富集到差异代谢物最多。
傅龙龙[9]（2019）在《人精子冷冻复苏过程中能量代谢功能紊乱的相关机制研究》文中进行了进一步梳理背景:精子冷冻保存是精子库的核心业务,包括志愿者精子冷冻保存和自体精子冷冻保存。前者是我国精子库的主要业务,而自体精子冷冻保存业务也逐渐受到重视。目的:评估我国男性生育力保存的现状,为减少肿瘤患者精子冷冻损伤提供建议方案。并研究精子冷冻损伤的相关机制,探寻改善冷冻复苏后精子质量的方法。方法:首先,我们回顾性分析了我们精子库自体精液冻存的相关数据,并比较了不同肿瘤患者在肿瘤治疗前精液参数的差异。机制研究部分,采用电镜、激光共聚焦、流式细胞术等方法检测精子冷冻复苏后线粒体结构和相关功能的改变。此外,采用数据非依赖采集的定量蛋白质组学和靶向代谢组学的方法,筛选冷冻复苏后精子的差异蛋白质和代谢物。随后,在前期研究结果的基础上,选取能量物质-左卡尼汀（LC）。探索其作为冷冻保护添加剂,对人冻存精子功能的影响。结果:10年来（2006年7月至2017年12月）,共有295位患者在我中心成功进行了自体精液冻存。在所有自体精液冷冻保存患者中,疾病及相关治疗的人数最多,共186人,占总人数63.1%。共有20名男性患者申请使用冻存精液,共接受43个周期辅助生殖技术治疗,最终16例婴儿成功分娩。肉瘤和白血病患者的精子总数、精子活力明显降低。睾丸肿瘤患者精子总数下降明显,但活力与对照组未见明显差异。睾丸肿瘤和白血病患者的精子复苏率降低明显。冻存复苏后精子线粒体结构疏松、线粒体嵴增宽,且部分呈空泡样改变;精子线粒体膜电位降低（MMP）,能量生成减少（ATP）;mtDNA拷贝数增加但完整性未见明显差异;而线粒体凋亡途径基因表达增多（Bax增加,Bcl-2减少）。其次,我们发现174个明显失调的蛋白质（上调蛋白质数76个,下调蛋白质数98个）和16个差异表达代谢物（9种代谢物上调,7种代谢物下调）。通过KEGG分析,焦距至糖代谢通路。与新鲜精子配对比较显示:6-磷酸葡萄糖异构酶（Glucose-6-phosphate isomerase,GPI）,乳糖脱氢酶-B（Lactate Dehydrogenase B,LDHB）,乙醇脱氢酶5（Alcohol Dehydrogenase 5,ADH5）和磷酸甘油酸变位酶1（Phosphoglyceratemutase1,PGAM1）四个糖酵解相关蛋白差异表达;L-乳酸、磷酸烯醇丙酮酸、D-葡萄糖和二羟丙酮磷酸盐4个糖酵解相关代谢物存在差异。最后,LC添加到冷冻保护剂可以改善冷冻复苏后精子活力和运动参数,减少冷冻损伤对于精子质膜和核DNA的完整性的破坏,但是对于精子顶体完整性无明显保护作用。LC可能通过抗氧化的作用,保护精子线粒体的功能（升高MMP）,减少ROS产生,增加ATP的产生;此外,LC可能通过参与乳酸和丙酮酸的调节,改善精子活力。结论:1.精子冷冻保存是男性生育力保存的有效方式。睾丸肿瘤、白血病和肉瘤会降低精液质量。2.冷冻复苏过程会导致精子线粒体结构紊乱和功能障碍。3.冷冻损伤会引起精子蛋白质和代谢物差异表达;通过生物信息学结果和蛋白验证提示:冷冻复苏过程会导致精子糖酵解功能紊乱。4.左卡尼汀作为冷冻保护添加剂,可以改善冷冻复苏后精子功能。
王胜男[10]（2020）在《转染食蟹猴精原干细胞产生转基因精子及冻存的研究》文中指出合适的动物模型对于人类疾病研究和药物开发至关重要。灵长类动物与人类高度相似,可以较好地模拟人类疾病的发生和发展的过程,因此灵长类动物模型是生物医学研究中最理想的动物模型。精原干细胞是位于睾丸组织曲细精管基底膜的一类具有自我更新和分化潜能的成体干细胞,可以源源不断地产生精子。因此,利用食蟹猴精原干细胞作为基因操作的对象,有望成为生产基因编辑灵长类动物疾病模型的一条有效途径。因此本研究的目的:1)体内途径,体内注射增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的慢病毒载体转染食蟹猴精原干细胞得到转基因的精子;2)体外途径,用EGFP慢病毒载体转染体外分离的精原干细胞,再将携带EGFP的精原干细胞注射到受体食蟹猴体内,获得携带EGFP的食蟹猴精子;3)建立和优化食蟹猴精子的无卵黄冷冻保存体系。结果显示:对体内途径获得的精子进行PCR检测及免疫组化的鉴定,成功得到了转基因的精子;对体外途径分离的精原干细胞能进行短暂的培养并成功将携带EGFP的精原干细胞注射到白消安造模的食蟹猴体内,但由于时间原因并未得到转基因的精子;添加浓度为0.1、1、10μg/m L的抗冻蛋白Ⅲ（AFPⅢ）到无卵黄冷冻液中,可以显着地提高精子的冷冻复苏存活率。当AFPⅢ浓度为0.1μg/m L时对精子的线粒体膜电位保护最好。本研究对精原干细胞的初步培养及基于精原干细胞制备基因编辑动物模型做了初步探讨,希望为精原干细胞方面的研究做出参考。
二、人类血清在精子体外培养中对精子活力影响的观察分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人类血清在精子体外培养中对精子活力影响的观察分析（论文提纲范文）
（1）奶山羊精子发生关键分子挖掘与性控精液研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 哺乳动物精子发生 |
| 1.1.1 精原干细胞自我更新与分化 |
| 1.1.2 精母细胞与减数分裂 |
| 1.1.3 圆形精子细胞变形及调控 |
| 1.1.4 睾丸发育与精子发生 |
| 1.2 精子发生相关lncRNA及其功能 |
| 1.2.1 LncRNA的形成和作用机制 |
| 1.2.2 LncRNA预测和分析数据库 |
| 1.2.3 LncRNA在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.3 单细胞转录组测序技术在精子发生中的应用 |
| 1.3.1 scRNA-seq技术发展概述 |
| 1.3.2 scRNA-seq技术在精子发生的研究进展 |
| 1.3.3 scRNA-seq技术在睾丸体细胞的研究进展 |
| 1.4 性控精液研究及应用概述 |
| 1.4.1 流式细胞仪分离X、Y精子研究进展 |
| 1.4.2 流式分选技术在牛性控精液的应用 |
| 1.4.3 流式分选技术在山羊性控精液的应用 |
| 1.4.4 基于基因/蛋白表达差异分离X、Y精子研究进展 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 奶山羊雄性生殖细胞与支持细胞发育规律研究 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要设备及试剂 |
| 2.1.3 睾丸石蜡包埋及组织切片 |
| 2.1.4 睾丸切片HE染色 |
| 2.1.5 免疫组织化学染色 |
| 2.1.6 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 奶山羊睾丸曲细精管发育规律 |
| 2.2.2 奶山羊未分化精原细胞发育规律 |
| 2.2.3 奶山羊未分化精原细胞的分化进程 |
| 2.2.4 奶山羊未分化精原细胞增殖规律 |
| 2.2.5 奶山羊曲细精管精母细胞发育规律 |
| 2.2.6 奶山羊曲细精管精子发育规律 |
| 2.2.7 奶山羊曲细精管支持细胞发育规律 |
| 2.2.8 奶山羊曲细精管支持细胞的增殖状态 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 奶山羊睾丸曲细精管组织发育规律分析 |
| 2.3.2 奶山羊曲细精管性原细胞的迁移进程 |
| 2.3.3 奶山羊曲细精管精原细胞的发育规律 |
| 2.3.4 奶山羊曲细精管支持细胞的发育规律 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 奶山羊精子发生关键lncRNA和 mRNA挖掘 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要设备及试剂 |
| 3.1.3 奶山羊睾丸曲细精管分离 |
| 3.1.4 奶山羊睾丸曲细精管组织RNA提取 |
| 3.1.5 RNA质检与建库 |
| 3.1.6 数据分析 |
| 3.1.7 qPCR验证 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 奶山羊性成熟前和性成熟后睾丸组织学差异 |
| 3.2.2 RNA-seq及数据质控 |
| 3.2.3 奶山羊基因组特征比对分析 |
| 3.2.4 奶山羊曲细精管长链非编码RNA的鉴定 |
| 3.2.5 奶山羊曲细精管长链非编码RNA和 mRNA特征分析 |
| 3.2.6 奶山羊性成熟前后长链非编码RNA和 mRNA差异表达分析 |
| 3.2.7 奶山羊精子发生相关mRNA的 GO和 KEGG分析 |
| 3.2.8 奶山羊精子发生相关lncRNA的 GO与 KEGG分析 |
| 3.2.9 奶山羊精子发生关键mRNA挖掘 |
| 3.2.10 奶山羊精子发生相关lncRNA-mRNA共表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 曲细精管组织样本为RNA-seq数据分析奠定良好基础 |
| 3.3.2 奶山羊曲细精管lncRNA特征分析 |
| 3.3.3 奶山羊精子发生关键分子挖掘 |
| 3.3.4 奶山羊精子发生关键重要信号通路挖掘 |
| 3.3.5 奶山羊精子发生关键lncRNA-mRNA挖掘 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 奶山羊精子发生单细胞转录图谱构建及关键分子挖掘 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要设备及试剂 |
| 4.1.3 主要数据库及数据分析软件 |
| 4.1.4 奶山羊睾丸曲细精管单细胞悬液制备 |
| 4.1.5 单细胞RNA-seq文库的制备和测序 |
| 4.1.6 单细胞RNA-seq数据分析 |
| 4.1.7 奶山羊雄性生殖细胞分化谱系构建 |
| 4.1.8 差异表达基因及功能富集分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 奶山羊曲细精管单细胞数据质控 |
| 4.2.2 奶山羊曲细精管主要细胞类型鉴定 |
| 4.2.3 奶山羊精子发生过程中主要细胞类型的分子特征 |
| 4.2.4 奶山羊精子发生与睾丸体细胞关键基因表达分析 |
| 4.2.5 奶山羊生殖细胞分化谱系构建及关键基因表达模式 |
| 4.2.6 奶山羊精子发生过程中涉及的细胞周期变化 |
| 4.2.7 奶山羊精原细胞关键基因挖掘与功能富集分析 |
| 4.2.8 scRNA-seq与RNA-seq精子发生关键mRNA比较分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 奶山羊曲细精管中主要细胞类型鉴定 |
| 4.3.2 奶山羊精子发生及睾丸体细胞关键基因挖掘 |
| 4.3.3 雄性生殖细胞与睾丸体细胞相互作用的关键分子特征 |
| 4.3.4 奶山羊雄性生殖细胞分化轨迹及精原细胞差异基因功能富集 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 奶山羊性染色体关键分子挖掘与性控精液研究 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验动物 |
| 5.1.2 主要设备及试剂 |
| 5.1.3 奶山羊性染色体编码基因鉴定 |
| 5.1.4 免疫组织化学染色 |
| 5.1.5 奶山羊精液采集 |
| 5.1.6 精液处理及精子浮游分选 |
| 5.1.7 奶山羊精子运动特征检测 |
| 5.1.8 奶山羊精子顶体完整率检测 |
| 5.1.9 奶山羊精子质膜完整率检测 |
| 5.1.10 奶山羊精子线粒体活性检测 |
| 5.1.11 奶山羊精子ATP水平检测 |
| 5.1.12 奶山羊精卵体外受精试验 |
| 5.1.13 奶山羊胚胎性别鉴定 |
| 5.1.14 Western Blotting检测奶山羊精子蛋白的表达变化 |
| 5.1.15 数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 奶山羊性染色体编码基因注释与编码受体基因鉴定 |
| 5.2.2 TLR7和TLR8在奶山羊睾丸、附睾和精子中的表达及定位 |
| 5.2.3 TLR7/8激活剂对奶山羊精子运动性能的影响 |
| 5.2.4 TLR7/8激活剂抑制X精子的运动能力 |
| 5.2.5 TLR7/8激活剂降低X精子ATP水平和线粒体活性 |
| 5.2.6 体外受精所得胚胎的性别鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 奶山羊性染色体关键基因挖掘 |
| 5.3.2 TLR7和TLR8在奶山羊X精子的尾部特异表达 |
| 5.3.3 TLR7/8信号通路激活抑制X精子的运动性能 |
| 5.3.4 TLR7/8信号通过GSK3α/β-己糖激酶途径影响X精子运动能力 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与创新点 |
| 6.1 研究结论 |
| 6.2 研究创新点 |
| 6.3 下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）基于ROS-MAPK-线粒体途径探讨补肾益精方治疗少弱精子症的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 文献综述 |
| 综述一 中医药治疗少弱精子症的临床研究进展 |
| 1 少弱精子症的定义 |
| 2 病因病机 |
| 3 辨证论治 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 氧化应激对男性精子质量的影响及研究进展 |
| 1 精液中氧化应激的产生 |
| 2 氧化应激对精子质量的影响 |
| 3 氧化应激对精子发生的影响 |
| 4 抗氧化应激治疗策略 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第一部分 基于网络药理学探讨补肾益精方治疗少弱精子症的作用机制 |
| 前言 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 补肾益精方对环磷酰胺诱导少弱精子症小鼠模型的作用及抗氧化应激研究 |
| 前目 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 补肾益精方对p38MAPK沉默后TM3细胞凋亡信号的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 补肾益精方对p38MAPK沉默后Sertoli细胞凋亡信号的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附件：YJD中药成分潜在靶点信息列表（共190个靶点） |
| 中医药科技查新报告书 |
（3）基于多组学联合分析对内蒙古绒山羊精液抗冻性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 山羊精液冷冻保存 |
| 1.2 影响精液抗冻性的因素 |
| 1.2.1 精浆 |
| 1.2.2 精子 |
| 1.2.3 冷冻保存程序 |
| 1.2.4 营养因素 |
| 1.3 蛋白质组学 |
| 1.3.1 TMT标记定量蛋白质组学概况 |
| 1.3.2 蛋白质组学在雄性生殖中的应用 |
| 1.4 代谢组学 |
| 1.4.1 非靶向代谢组学概况 |
| 1.4.2 代谢组学在雄性生殖中的应用 |
| 1.5 脂质组学 |
| 1.5.1 脂质组学概况 |
| 1.5.2 脂质组学在雄性生殖中的应用 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 1.7 技术路线图 |
| 2 研究一内蒙古绒山羊精液抗冻性筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 精液采集与稀释液配置 |
| 2.2 精液冷冻保存及抗冻性筛选 |
| 2.2.1 个体抗冻性的分类 |
| 2.2.2 去除精浆后的内蒙古绒山羊精液冷冻保存效果的影响 |
| 2.2.3 交换精浆后的内蒙古绒山羊精液冷冻保存效果的影响 |
| 2.3 精子质量检测 |
| 2.3.1 精子运动性能检测 |
| 2.3.2 精子结构完整性检测 |
| 2.3.3 冷冻精液的人工输精 |
| 2.3.4 数据分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 绒山羊精液抗冻性的分类 |
| 2.4.2 去除精浆对精子抗冻性的影响 |
| 2.4.3 交换精浆对精子抗冻性的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 抗冻性对内蒙古绒山羊精液冷冻保存效果的影响 |
| 2.5.2 抗冻性对去除精浆后的内蒙古绒山羊精液冷冻保存效果的影响 |
| 2.5.3 抗冻性对交换精浆后的内蒙古绒山羊精液冷冻保存效果的影响 |
| 2.6 小结 |
| 3 研究二基于TMT标记定量蛋白质组学对内蒙古绒山羊精浆抗冻性的研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验样品 |
| 3.1.2 主要仪器与分析软件 |
| 3.1.3 主要试剂和耗材 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 蛋白质提取和肽段裂解 |
| 3.2.2 SDS-PAGE电泳 |
| 3.2.3 FASP酶解 |
| 3.2.4 TMT标记 |
| 3.2.5 High pH Reversed-Phase肽段分级 |
| 3.2.6 高效液相色谱-质谱分析(LC-MS/MS) |
| 3.2.7 蛋白质鉴定和定量分析 |
| 3.2.8 生物信息学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 蛋白质提取质控评价 |
| 3.3.2 质谱稳定性与重复性质控结果 |
| 3.3.3 蛋白质鉴定结果 |
| 3.3.4 差异表达蛋白质筛选 |
| 3.3.5 差异表达蛋白质聚类分析(Clustering) |
| 3.3.6 差异表达蛋白质Gene Ontology(GO)功能富集分析 |
| 3.3.7 差异表达蛋白质KEGG通路富集分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 研究三基于非靶向代谢组学对内蒙古绒山羊精浆抗冻性的研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验样品 |
| 4.1.2 主要仪器和试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 样品预处理方法 |
| 4.2.2 色谱-质谱分析 |
| 4.2.3 数据处理 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 试验质量控制 |
| 4.3.2 数据分析 |
| 4.3.3 显着性差异代谢物筛选 |
| 4.3.4 差异代谢物聚类分析 |
| 4.3.5 差异代谢物KEGG通路分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 研究四蛋白质组-代谢组联合分析内蒙古绒山羊精浆抗冻性相关生物标记 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验样品 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.1.3 蛋白质组和代谢组联合分析 |
| 5.1.4 Western Blot实验步骤 |
| 5.1.5 精浆矿物质离子检测 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 差异蛋白质和差异代谢物KEGG通路整合分析 |
| 5.2.2 FTH1 蛋白和TF蛋白的Western Blot结果 |
| 5.2.3 内蒙古绒山羊精浆中矿物质离子浓度检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 6 研究五基于非靶向脂质组学对内蒙古绒山羊精子抗冻性的研究 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 试验样品 |
| 6.1.2 实验仪器和试剂 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 样本预处理方法 |
| 6.2.2 色谱-质谱分析 |
| 6.2.3 数据分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 试验质量控制 |
| 6.3.2 脂类化合物鉴定数量 |
| 6.3.3 脂质亚类(Lipid class)水平分析 |
| 6.3.4 脂质分子(Lipid species)水平分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7 结论、创新点及展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（4）雄激素对绵羊附睾谷胱甘肽过氧化物酶5抗氧化的调节机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 附睾的结构与功能 |
| 1.1.1 附睾的结构 |
| 1.1.2 附睾的基因表达 |
| 1.1.3 附睾功能的调节 |
| 1.1.4 附睾液的组分 |
| 1.1.5 附睾对精子成熟的作用 |
| 1.2 附睾抗氧化 |
| 1.2.1 ROS与精子 |
| 1.2.2 附睾中的抗氧化剂 |
| 1.3 EECs体外培养 |
| 1.3.1 EECs体外培养的意义 |
| 1.3.2 EGF概述 |
| 1.3.3 海藻糖概述 |
| 1.4 附睾特异性表达的GPX5 |
| 1.4.1 GPX5 基因的结构与定位 |
| 1.4.2 GPX5 基因的表达特性 |
| 1.4.3 GPX5 基因的功能研究 |
| 1.4.4 GPX5 基因的调节机制 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 实验一、EGF经 EGFR/PI3K/AKT通路激活FOXO1 磷酸化促进绵羊EECs体外增殖 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 EECs的体外分离培养与鉴定 |
| 2.2.2 EECs的体外传代培养 |
| 2.2.3 EECs的鉴定 |
| 2.2.4 EECs生长曲线测定 |
| 2.2.5 EGF体外对绵羊EECs功能的影响 |
| 2.2.6 EGF对 EECs细胞周期的影响 |
| 2.2.7 EECs的凋亡测定 |
| 2.2.8 EGFR和 PI3K/AKT通路抑制剂对细胞周期分布和细胞凋亡率的影响 |
| 2.2.9 EGFR和 PI3K/AKT通路抑制剂对EGFR、AKT和 FOXO1 磷酸化水平的影响 |
| 2.2.10 数据统计与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 绵羊EECs分离培养 |
| 2.3.2 绵羊成纤维细胞分离与纯化 |
| 2.3.3 绵羊EECs的鉴定 |
| 2.3.4 EGF对绵羊EECs体外增殖的影响 |
| 2.3.5 EGF对 EECs体外培养传代的影响 |
| 2.3.6 EGF维持绵羊EECs的表达特性 |
| 2.3.7 EGF对 EECs细胞周期及凋亡的影响 |
| 2.3.8 EGFR和 PI3K/AKT通路抑制剂对细胞周期分布和细胞凋亡率的影响 |
| 2.3.9 EGF 影响 EECs 细胞 FOXO1 磷酸化 |
| 2.4 讨论 |
| 3 实验二、海藻糖在绵羊EECs体外增殖过程中的抗氧化作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 EECs分离培养与传代 |
| 3.2.2 EECs生长曲线测定 |
| 3.2.3 EECs细胞周期检测 |
| 3.2.4 EECs细胞凋亡检测 |
| 3.2.5 海藻糖对绵羊EECs表达特性的维持 |
| 3.2.6 ROS检测 |
| 3.2.7 SOD酶活性检测 |
| 3.2.8 CAT酶活性检测 |
| 3.2.9 GPXs酶活性检测 |
| 3.2.10 qRT-PCR检测GPX5 m RNA表达量 |
| 3.2.11 ELISA检测GPX5 蛋白表达量 |
| 3.2.12 数据统计与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 海藻糖有助于提高绵羊EECs活性 |
| 3.3.2 海藻糖改变绵羊EECs细胞周期分布 |
| 3.3.3 海藻糖抑制绵羊EECs凋亡 |
| 3.3.4 海藻糖维持绵羊EECs功能特性 |
| 3.3.5 海藻糖对EECs内 ROS和抗氧化酶的作用 |
| 3.3.6 海藻糖对EECs内 GPX5 表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 4 实验三、绵羊附睾GPX5 基因的抗氧化功能 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验细胞 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊EECs的 siRNA-GPX5 的瞬时转染 |
| 4.2.2 qRT-PCR检测GPX5 mRNA表达量 |
| 4.2.3 ELISA检测GPX5 蛋白表达量 |
| 4.2.4 CCK-8 检测细胞增殖 |
| 4.2.5 ROS检测 |
| 4.2.6 MDA检测 |
| 4.2.7 8-OHd G检测 |
| 4.2.8 抗氧化酶mRNA表达量检测 |
| 4.2.9 数据统计与分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 RT-PCR检测干扰的EECs GPX5 mRNA表达量 |
| 4.3.2 ELISA检测干扰的EECs GPX5 蛋白表达量 |
| 4.3.3 GPX5 干扰对EECs抗氧化应激的影响 |
| 4.3.4 GPX5 干扰对EECs中 ROS含量的影响 |
| 4.3.5 GPX5 干扰对EECs脂质过氧化的影响 |
| 4.3.6 GPX5 干扰的EECs中8-OHd G含量 |
| 4.3.7 雄激素对GPX5 干扰的EECs抗氧化基因表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 5 实验四、睾酮、AR和共调节因子对绵羊附睾GPX5 表达的调节 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 睾酮处理的EECs生长曲线测定 |
| 5.2.2 qRT-PCR检测GPX5、AR和共调节因子mRNA表达量 |
| 5.2.3 睾酮对GPX5、AR和共调节因子蛋白表达的免疫荧光分析 |
| 5.2.4 睾酮对GPX5、AR和共调节因子蛋白表达的相对定量分析 |
| 5.2.5 siRNA干扰AR对 GPX5、SRC-1和p300 表达的影响 |
| 5.2.6 AR过表达对GPX5 表达的影响 |
| 5.2.7 双荧光素酶报告基因检测AR与GPX5 的结合作用及结合位点 |
| 5.2.8 绵羊EECs siRNA-SRC-1和siRNA-p300 的瞬时转染 |
| 5.2.9 siRNA-SRC-1和siRNA-p300 干扰效率检测 |
| 5.2.10 绵羊EECs干扰SRC-1或p300后GPX5和AR表达量检测 |
| 5.2.11 绵羊EECs SRC-1和p300对AR活性的影响 |
| 5.2.12 数据统计与分析 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 不同浓度睾酮对绵羊 EECs 体外增殖的影响 |
| 5.3.2 睾酮对绵羊EECs中 GPX5 表达的影响 |
| 5.3.3 睾酮对绵羊EECs中 AR表达的影响 |
| 5.3.4 睾酮对绵羊EECs中 AR共调节因子表达的影响 |
| 5.3.5 AR以序列特定的方式调节绵羊GPX5 的表达 |
| 5.3.6 AR调节绵羊EECs SRC-1和p300 蛋白的表达 |
| 5.3.7 SRC-1和p300 调节绵羊EECs GPX5 的表达 |
| 5.3.8 SRC-1和p300 对绵羊EECs AR表达和转录活性的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 6 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）猪隐睾睾丸精子发生障碍的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 隐睾症及其激素调节机制的研究进展 |
| 1.1 隐睾症 |
| 1.2 隐睾症流行病学研究 |
| 1.3 隐睾症激素调节机制的研究 |
| 2 隐睾影响哺乳动物精子发生的研究进展 |
| 2.1 哺乳动物精子发生 |
| 2.2 隐睾影响精子发生的研究 |
| 3 隐睾睾丸形态计量学研究进展 |
| 3.1 隐睾睾丸细胞计数的研究 |
| 3.2 隐睾睾丸生殖细胞和支持细胞的研究 |
| 4 隐睾睾丸细胞增殖研究进展 |
| 4.1 增殖相关蛋白的研究 |
| 4.2 睾丸细胞增殖的研究 |
| 4.3 隐睾影响睾丸细胞增殖的研究 |
| 5 隐睾睾丸细胞凋亡的研究进展 |
| 5.1 凋亡的概念及分子机制的研究 |
| 5.2 凋亡调节哺乳动物精子发生的研究 |
| 5.3 隐睾影响精子发生的凋亡信号研究 |
| 6 隐睾睾丸自噬的研究进展 |
| 6.1 自噬的概念及作用机制的研究 |
| 6.2 自噬调节精子发生的研究 |
| 6.3 隐睾睾丸自噬的分子机制研究 |
| 7 隐睾睾丸支持细胞间血睾屏障研究进展 |
| 7.1 血睾屏障紧密连接分子组成的研究 |
| 7.2 隐睾影响血睾屏障紧密连接分子的研究 |
| 8 转录组测序技术在隐睾睾丸的研究进展 |
| 8.1 转录组与转录组测序技术 |
| 8.2 转录组测序技术在睾丸基因表达差异的研究 |
| 8.3 转录组测序技术在隐睾睾丸基因表达差异的研究 |
| 9 蛋白质组学技术在隐睾睾丸的研究进展 |
| 9.1 蛋白质组学与蛋白质组学技术 |
| 9.2 蛋白质组学技术在睾丸蛋白表达差异的研究 |
| 9.3 蛋白质组学技术在隐睾睾丸蛋白表达差异的研究 |
| 10 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 自发单侧隐睾公猪睾丸支持细胞和生殖细胞数量的变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 制作石蜡切片 |
| 2.2 HE染色 |
| 2.3 睾丸的形态计量学 |
| 2.4 睾丸细胞计数 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 猪睾丸组织形态学变化 |
| 3.2 猪睾丸组织形态计量学变化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 自发单侧隐睾对公猪睾丸增殖和凋亡相关蛋白表达与定位的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 TUNEL法检测细胞凋亡 |
| 2.2 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2.1 总RNA提取 |
| 2.2.2 cDNA合成 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 qRT-PCR |
| 2.3 总蛋白提取和Western Blot |
| 2.3.1 总蛋白提取 |
| 2.3.2 Western Blot |
| 2.4 免疫荧光化学 |
| 2.5 免疫组织化学 |
| 2.6 数据统计与分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 隐睾对生殖细胞凋亡的影响 |
| 3.2 隐睾对猪睾丸增殖和凋亡相关基因mRNA表达水平的影响 |
| 3.3 隐睾对猪睾丸增殖和凋亡相关蛋白表达量的影响 |
| 3.4 隐睾对猪睾丸增殖和凋亡相关蛋白定位的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 隐睾对猪睾丸生殖细胞和支持细胞增殖的影响 |
| 4.2 隐睾对猪睾丸生殖细胞和支持细胞凋亡的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 自发单侧隐睾对公猪睾丸自噬相关蛋白表达与定位的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2 总蛋白提取和Western Blot |
| 2.3 免疫组织化学 |
| 2.4 数据统计与分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 隐睾对猪睾丸自噬相关基因LC3、p62和Beclin1 mRNA表达水平的影响 |
| 3.2 隐睾对猪睾丸自噬相关蛋白LC3、p62和Beclin1表达水平的影响 |
| 3.3 隐睾对猪睾丸自噬蛋白LC3定位的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 自发单侧隐睾对公猪睾丸血睾屏障紧密连接分子表达与定位的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2 总蛋白提取和Western Blot |
| 2.3 免疫组织化学 |
| 2.4 数据统计与分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 隐睾对猪睾丸血睾屏障紧密连接相关基因Claudin-11、Occludin和ZO-1mRNA表达水平的影响 |
| 3.2 隐睾对猪睾丸血睾屏障紧密连接相关蛋白Claudin-11、Occludin和ZO-1表达水平的影响 |
| 3.3 隐睾对猪睾丸支持细胞标记蛋白GATA-4 定位的影响 |
| 3.4 隐睾对猪睾丸血睾屏障紧密连接相关蛋白Claudin-11、Occludin和ZO-1定位的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 单侧隐睾对大鼠睾丸血睾屏障通透性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 大鼠隐睾模型的建立 |
| 2.2 免疫组织化学 |
| 2.3 血睾屏障通透性检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 隐睾对大鼠睾丸血睾屏障紧密连接相关蛋白Claudin-11和ZO-1定位的影响 |
| 3.2 隐睾对大鼠睾丸血睾屏障通透性的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第七章 转录组学分析自发单侧隐睾对公猪睾丸基因表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 断奶前仔猪、隐睾和对侧阴囊睾丸的转录组学分析 |
| 3.2 差异基因GO分析 |
| 3.3 差异基因KEGG分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 隐睾对精原细胞分化的影响 |
| 4.2 隐睾对生殖细胞减数分裂的影响 |
| 4.3 隐睾对细胞间连接的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第八章 蛋白组学分析自发单侧隐睾对公猪睾丸蛋白表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 蛋白的鉴定 |
| 3.2 蛋白定量和差异蛋白筛选 |
| 3.3 差异表达蛋白GO分析 |
| 3.4 差异表达蛋白KEGG分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 隐睾对睾酮产生的影响 |
| 4.2 隐睾对细胞周期的影响 |
| 4.3 隐睾对细胞连结的影响 |
| 4.4 隐睾对代谢的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| Abstract |
| 英文缩写对照表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）褪黑素在绵羊附睾中的合成及其对附睾上皮细胞生理功能的调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 附睾组织结构和功能 |
| 1.1 附睾的结构 |
| 1.2 附睾的功能 |
| 2 雄激素 |
| 2.1 双氢睾酮与附睾功能 |
| 3 褪黑素相关研究 |
| 3.1 褪黑素的发现 |
| 3.2 褪黑素的生物合成 |
| 3.3 褪黑素的代谢途径 |
| 4 褪黑素的生物学功能 |
| 4.1 褪黑素的抗氧化作用 |
| 4.2 褪黑素对免疫反应的调节作用 |
| 4.3 褪黑素的抗肿瘤作用 |
| 4.4 褪黑素对炎症反应的调节作用 |
| 5 褪黑素受体及其信号转导过程 |
| 5.1 褪黑素受体分类 |
| 5.2 褪黑素受体信号转导过程 |
| 5.3 褪黑素受体MT1 和MT2 的拮抗剂和激动剂 |
| 6 褪黑素对雄性动物生殖生理的调控作用 |
| 6.1 褪黑素对附睾功能的影响 |
| 6.2 褪黑素对精子的影响 |
| 7 蛋白质组学研究 |
| 7.1 蛋白质组学的介绍 |
| 7.2 蛋白质组学在附睾中的应用 |
| 8 小结 |
| 第二章 褪黑素及其合成酶和膜受体在雄性绵羊附睾中的表达分布 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 样品 |
| 1.2 试剂和仪器 |
| 1.3 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 绵羊附睾中褪黑素含量的检测 |
| 2.2 AANAT、HIOMT、MT1和MT2 m RNA在绵羊附睾中的表达 |
| 2.3 AANAT、HIOMT、MT1和MT2蛋白在绵羊附睾中的表达 |
| 2.4 绵羊附睾的结构及AANAT、HIOMT、MT1和MT2 蛋白在绵羊附睾中的免疫组化检测 |
| 2.5 AANAT、HIOMT、MT1和MT2 蛋白在绵羊附睾中的免疫荧光检测 |
| 2.6 MT1 和MT2 蛋白在绵羊附睾精子中的免疫荧光检测 |
| 2.7 MT1 和MT2 蛋白在绵羊附睾精子中表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 褪黑素对附睾上皮细胞双氢睾酮分泌的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 样品 |
| 1.2 试剂和仪器 |
| 1.3 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同浓度褪黑素对绵羊附睾上皮细胞双氢睾酮浓度的影响 |
| 2.2 不同浓度褪黑素对绵羊附睾上皮细胞中5α-red1和5α-red2 的影响 |
| 2.3 MT1 和MT2 在体外培养的附睾上皮细胞的表达 |
| 2.4 褪黑素和 4P-PDOT 或 luzindole 对绵羊附睾上皮细胞中双氢睾酮分泌的影响 |
| 2.5 褪黑素和4P-PDOT或 luzindole对绵羊附睾上皮细胞中5α-red1 和5α-red2 表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 附睾头上皮细胞iTRAQ蛋白质组学分析 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 样品 |
| 1.2 试剂和仪器 |
| 1.3 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 绵羊附睾头上皮细胞中蛋白鉴定及定量分析 |
| 2.2 差异表达蛋白生物信息学分析 |
| 2.3 差异表达蛋白q PCR和 Western blotting分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 褪黑素对LPS诱导绵羊附睾上皮细胞炎症反应的调控作用 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 样品 |
| 1.2 试剂和仪器 |
| 1.3 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 褪黑素抑制LPS诱导的绵羊附睾上皮细胞炎症反应 |
| 2.2 褪黑素抑制LPS诱导的附睾上皮细胞中TLR4 表达和NF-κB活性 |
| 2.3 褪黑素和4P-PDOT或 luzindole对 LPS处理的附睾上皮细胞中炎性基因表达的影响 |
| 2.4 褪黑素和luzindole或4P-PDOT对 LPS诱导的附睾上皮细胞中TLR4表达和NF-κB活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
（7）双酚AF对小鼠血睾屏障和精子发生的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 内分泌干扰物简介及危害 |
| 1.2 双酚AF研究进展 |
| 1.2.1 BPAF在环境中的普遍性 |
| 1.2.2 BPAF的毒理学效应 |
| 1.3 精子发生与血睾屏障 |
| 1.3.1 精子发生 |
| 1.3.2 支持细胞与血睾屏障 |
| 1.3.3 血睾屏障调控机制 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 2 实验材料及研究方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 试验动物和伦理申明 |
| 2.1.2 主要生化试剂 |
| 2.1.3 实验所需溶液及配方 |
| 2.1.4 实验仪器设备 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 试验动物灌胃处理方案 |
| 2.2.2 样品采集 |
| 2.2.3 精子质量分析 |
| 2.2.4 血清睾酮测定 |
| 2.2.5 睾丸和附睾形态学检测 |
| 2.2.6 血睾屏障功能完整性分析 |
| 2.2.7 支持细胞分离和体外培养 |
| 2.2.8 细胞毒性试验 |
| 2.2.9 支持细胞内ROS和Ca~(2+)浓度检测 |
| 2.2.10 支持细胞屏障功能检测 |
| 2.2.11 免疫荧光(Immunofluorescent,IF)和激光共聚焦 |
| 2.2.12 免疫印迹(Western blot) |
| 2.2.13 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 BPAF对小鼠生长发育的影响 |
| 3.2 BPAF对小鼠睾丸和附睾组织结构的影响 |
| 3.3 BPAF降低小鼠血清中睾酮水平 |
| 3.4 BPAF对小鼠精子数量和质量的影响 |
| 3.5 BPAF诱导精子氧化损伤 |
| 3.6 BPAF降低精子顶体膜完整性并改变蛋白质翻译后修饰方式 |
| 3.7 BPAF破坏血睾屏障完整性 |
| 3.8 BPAF损伤支持细胞屏障功能 |
| 3.9 BPAF破坏支持细胞骨架结构 |
| 3.10 BPAF通过ERK1/2 信号通路干扰支持细胞屏障功能 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 创新与不足 |
| 创新之处 |
| 不足之处 |
| 参考文献 |
| 附表1:实验所用抗体信息 |
| 附录2 :在读期间学术成果 |
| 致谢 |
（8）许氏平鲉精子长期储存及能量代谢研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鱼类的生殖策略 |
| 1.2 精子储存 |
| 1.2.1 精子储存时间 |
| 1.2.2 精子储存器官 |
| 1.2.3 精子储存的分子机制 |
| 1.3 精子的代谢底物与途径 |
| 1.4 精子结构与精子储存的适应性关系 |
| 1.4.1 脊椎动物精子结构 |
| 1.4.2 鱼类精子结构 |
| 1.5 许氏平鲉的生物学特征 |
| 1.6 许氏平鲉精子储存及能量代谢的研究现状 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 第二章 体内受精许氏平鲉与体外受精大菱鲆精子结构及生理特性比较 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 亲鱼来源及精液采集 |
| 2.2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.3 扫描电镜 |
| 2.2.4 透射电镜 |
| 2.2.5 精子运动指标 |
| 2.2.6 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 许氏平鲉精子结构 |
| 2.3.2 大菱鲆精子结构 |
| 2.3.3 许氏平鲉与大菱鲆精子生理特性及运动特征比较 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 许氏平鲉精子长期储存及其周围卵巢发育变化特征 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验仪器与试剂 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 生物学指标的测量与计算 |
| 3.2.4 组织学切片 |
| 3.2.5 精子储存期间精子运动状态观察 |
| 3.2.6 数据分析与处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 许氏平鲉精子发生过程 |
| 3.3.2 许氏平鲉繁殖周期生理指标 |
| 3.3.3 许氏平鲉卵巢的组织学观察 |
| 3.3.4 精子存储期间滤泡层细胞发育规律 |
| 3.3.5 许氏平鲉精子存储状态 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 许氏平鲉精子长期储存的代谢底物与途径分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料方法 |
| 4.2.1 实验仪器与试剂 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 非靶向代谢组学分析许氏平鲉卵巢液微环境 |
| 4.2.4 精子及卵巢液中能量底物的检测 |
| 4.2.5 精子的体外培养及代谢底物检测 |
| 4.2.6 许氏平鲉精子药物阻断与代谢途径检测 |
| 4.2.7 数据处理与分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 许氏平鲉精子储存卵巢内微环境分析 |
| 4.3.2 许氏平鲉卵巢液代谢底物含量 |
| 4.3.3 体外培养精子寿命观测 |
| 4.3.4 许氏平鲉的能量代谢途径探索 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 许氏平鲉卵巢微环境分析 |
| 4.4.2 许氏平鲉精子的能量底物 |
| 4.4.3 许氏平鲉精子的能量代谢 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（9）人精子冷冻复苏过程中能量代谢功能紊乱的相关机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 人精子冷冻损伤 |
| 1.1 冰晶形成 |
| 1.2 氧化应激 |
| 1.3 冷冻保护剂 |
| 2. 精子冷冻保存的临床应用 |
| 2.1 捐精志愿者精液冻存 |
| 2.2 自体精液冷冻保存 |
| 2.3 自体精液冷冻保存现状 |
| 3. 论文概述 |
| 第一节 国家卫健委科研所精子库自体精液冷冻保存10年数据回顾性分析 |
| 前言 |
| 资料和方法 |
| 1. 研究伦理 |
| 2. 实验设计 |
| 3. 咨询流程 |
| 4. 精液质量评估 |
| 5. 传染病及相关检查 |
| 6. 精子冷冻和复苏 |
| 7. 分析统计 |
| 结果 |
| 1. 自体精液冷冻保存人数及年变化趋势 |
| 2. 自体精液冷冻保存患者年龄 |
| 3. 自体精液冷冻保存原因分类 |
| 4. 冻存精液使用情况和生育结局 |
| 5. 肿瘤对精子质量的影响 |
| 讨论 |
| 第二节 冷冻复苏过程中人精子线粒体功能的损伤 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 研究伦理 |
| 2. 实验设计 |
| 3. 主要实验材料 |
| 4. 精液收集 |
| 5. 精子冷冻和复苏方案 |
| 6. CASA检测精子活力参数 |
| 7. 精子超微结构检测 |
| 8. 精子结构完整性检测 |
| 9. 精子氧化应激检测 |
| 10. 精子线粒体功能检测 |
| 结果 |
| 1. 捐精志愿者一般资料 |
| 2. 冷冻复苏降低精子活力及运动参数 |
| 3. 冷冻复苏对精子结构的影响 |
| 4. 冷冻复苏对ROS和抗氧化还原产物的影响 |
| 5. 冷冻复苏对精子线粒体膜电位的影响 |
| 6. 冷冻复苏对精子ATP的影响 |
| 7. 冷冻复苏对精子线粒体DNA拷贝数和完整性的影响 |
| 8. 冷冻复苏对线粒体凋亡基因的影响 |
| 讨论 |
| 第三节 糖酵解紊乱在人精子冷冻复苏中的影响--基于蛋白质组学和代谢组学的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 研究伦理 |
| 2. 实验设计 |
| 3. 主要实验材料 |
| 4. 蛋白质组学分析 |
| 5. 靶向代谢组学分析 |
| 6. 精子蛋白Western Blot分析 |
| 7. 精子蛋白免疫荧光分析 |
| 8. 统计分析 |
| 结果 |
| 1. Peak capacity峰能力 |
| 2. iRT的保留时间 |
| 3. 差异蛋白质定量结果 |
| 4. Pathway代谢通路富集注释和PPI蛋白相互作用网络分析 |
| 5. 差异代谢物鉴定及KEGG富集分析 |
| 6. 冷冻复苏对精子糖酵解蛋白的影响 |
| 讨论 |
| 第四节 左卡尼汀(LC)减少人精子冷冻损伤的作用机制研究 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 1. 研究伦理 |
| 2. 实验设计 |
| 3. 主要实验材料 |
| 4. 精液收集和处理 |
| 5. 精液冷冻复苏 |
| 6. Markler计数板联合CASA法评估精子活力 |
| 7. 精子膜完整性检测 |
| 8. 精子顶体完整性检测 |
| 9. 精子核DNA完整性检测 |
| 10. 精子氧化应激检测 |
| 11. 精子MMP电位检测 |
| 12. 精子ATP检测 |
| 13. 糖代谢指标测定 |
| 14. 统计学分析 |
| 结果 |
| 1. 不同浓度LC对冷冻复苏后精子活力及运动参数的影响 |
| 2. LC对冷冻复苏后精子相关功能的影响 |
| 3. LC对冷冻复苏后精子线粒体功能的影响 |
| 4. LC对冷冻复苏后精子糖代谢指标的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附录 |
| 附表1 DIA蛋白质组学差异蛋白 |
| 参考文献 |
| 综述 男性肿瘤患者的生育力保存 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表论文及科研情况 |
| 致谢 |
（10）转染食蟹猴精原干细胞产生转基因精子及冻存的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 实验仪器及耗材 |
| 实验试剂与药品 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 食蟹猴 |
| 1.2.1 食蟹猴形态特征及其分布 |
| 1.2.2 食蟹猴研究现状 |
| 1.3 基因修饰方法及技术手段 |
| 1.3.1 基因修饰的主要方法 |
| 1.3.2 基因修饰的主要技术手段 |
| 1.4 食蟹猴在基因修饰中的应用 |
| 1.5 精原干细胞 |
| 1.5.1 精原干细胞的生物学特征及鉴定 |
| 1.5.2 精原干细胞的分离纯化及体外培养 |
| 1.5.3 基于精原干细胞介导的基因编辑动物模型 |
| 1.6 转基因精子低温冷冻保存的意义 |
| 1.6.1 精子冷冻保存的原理 |
| 1.6.2 冷冻保护剂与冷冻 |
| 1.6.3 冷冻方法 |
| 1.6.4 冷冻损伤 |
| 第二章 慢病毒转染食蟹猴体内精原干细胞 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 增强型绿色荧光蛋白(EGFP)慢病毒稀释液的制备 |
| 2.2.2 受体食蟹猴慢病毒的注射 |
| 2.2.3 受体食蟹猴注射EGFP慢病毒稀释液后携带EGFP情况 |
| 2.2.4 携带EGFP基因的受体食蟹猴精子显微注射到卵子中 |
| 2.2.5 胚胎检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 受体食蟹猴EGFP慢病毒注射结果 |
| 2.3.2 曲细精管组织的分离及精原干细胞免疫荧光检测 |
| 2.3.3 免疫组化检测 |
| 2.3.4 精子EGFP检测结果 |
| 2.3.5 胚胎EGFP检测结果 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 精原干细胞体外初期培养及异体移植 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 溶液的配制 |
| 3.1.3 细胞计数 |
| 3.2 受体食蟹猴的制备 |
| 3.2.1 白消安造模 |
| 3.3 精原干细胞的分离培养 |
| 3.3.1 食蟹猴支持细胞的分离培养 |
| 3.3.2 饲养层的制备 |
| 3.3.3 食蟹猴睾丸组织的分离 |
| 3.3.4 食蟹猴睾丸组织分离的总细胞裂红处理 |
| 3.3.5 利用不连续密度梯度离心法初步纯化食蟹猴精原干细胞 |
| 3.3.6 食蟹猴精原干细胞培养 |
| 3.3.7 EGFP慢病毒转染食蟹猴精原干细胞 |
| 3.3.8 EGFP转染的精原干细胞异体移植到白消安造模的食蟹猴体内 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 白消安造模免疫组化结果 |
| 3.4.2 食蟹猴支持细胞的培养及鉴定结果 |
| 3.4.3 食蟹猴支持细胞支原体检测结果 |
| 3.4.4 食蟹猴精原干细胞原代至形成可传代集落 |
| 3.4.5 EGFP慢病毒转染食蟹猴精原干细胞结果 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 食蟹猴精子冷冻保存 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 溶液配制 |
| 4.2 精子冻存及检测方法 |
| 4.2.1 Ⅲ型抗冻蛋白(Type Ⅲ AFP)提取及纯化 |
| 4.2.2 精子收集及冷冻 |
| 4.2.3 精子质量检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 Ⅲ型AFP结果 |
| 4.3.2 精子运动度结果 |
| 4.3.3 精子顶体完整性评估结果 |
| 4.3.4 线粒体膜电位评估结果 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读学位期间发表论文目录 |
四、人类血清在精子体外培养中对精子活力影响的观察分析（论文参考文献）
- [1]奶山羊精子发生关键分子挖掘与性控精液研究[D]. 任发. 西北农林科技大学, 2021
- [2]基于ROS-MAPK-线粒体途径探讨补肾益精方治疗少弱精子症的作用机制[D]. 曹. 中国中医科学院, 2021(02)
- [3]基于多组学联合分析对内蒙古绒山羊精液抗冻性的研究[D]. 徐冰冰. 内蒙古农业大学, 2021
- [4]雄激素对绵羊附睾谷胱甘肽过氧化物酶5抗氧化的调节机制研究[D]. 栾兆进. 内蒙古农业大学, 2021
- [5]猪隐睾睾丸精子发生障碍的分子机制研究[D]. 范小瑞. 山西农业大学, 2021(02)
- [6]褪黑素在绵羊附睾中的合成及其对附睾上皮细胞生理功能的调控研究[D]. 葛闻博. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [7]双酚AF对小鼠血睾屏障和精子发生的影响及其机制研究[D]. 吴迪. 华中农业大学, 2020
- [8]许氏平鲉精子长期储存及能量代谢研究[D]. 赵海霞. 中国科学院大学(中国科学院海洋研究所), 2020(01)
- [9]人精子冷冻复苏过程中能量代谢功能紊乱的相关机制研究[D]. 傅龙龙. 北京协和医学院, 2019(02)
- [10]转染食蟹猴精原干细胞产生转基因精子及冻存的研究[D]. 王胜男. 昆明理工大学, 2020(05)